Método de cultivo celular para el control de la producción de ácido láctico a niveles reducidos en un cultivo celular alimentado por lotes,

que comprende:

la mezcla de células animales y un medio con el fin de formar un cultivo celular, y

la alimentación de glucosa de una manera restringida al cultivo celular a una tasa que es una función de una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa por parte de las células animales cultivadas en un medio que contiene un nivel elevado de glucosa,

en el que la función es la multiplicación de la tasa esperada por un porcentaje inferior a 100%

Alimentación restringida de glucosa para el cultivo de células animales.

Campo de la invención

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente US nº de serie 60/470.937, presentada el 15 de mayo de 2003, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a un método para mejorar la producción de proteínas mediante el cultivo de células animales. Más específicamente, la invención se refiere a un método para controlar la producción de ácido láctico mediante el cultivo de células animales (preferentemente células de mamífero) a niveles reducidos en un cultivo celular alimentado por lotes. En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para mantener la producción de lactato por parte de células en cultivo a niveles reducidos mediante la utilización de sistemas de administración de glucosa que no se basan en el muestreo de cultivos a intervalos regulares. En particular, la invención se refiere al cultivo de células animales bajo condiciones en las que se alimenta glucosa al cultivo o se introduce en el mismo, de una manera restringida, por ejemplo a una tasa que es una función de una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa por parte de las células animales al exponerlas a un medio que contiene un nivel elevado de glucosa. Asociado a dicha alimentación restringida, se controla la producción por parte de células en cultivo a un nivel reducido durante el cultivo. Como resultado final, se incrementa la producción de proteínas recombinantes a partir de las células en cultivo, por ejemplo con el fin de facilitar la producción a escala comercial.

Una gran proporción de productos biotecnológicos, se encuentran disponibles comercialmente o sólo en desarrollo, son proteínas terapéuticas. Además, la maquinaria celular de una célula animal (en comparación con una célula bacteria) generalmente resulta necesaria para producir muchas formas de proteínas terapéuticas (por ejemplo proteínas glucosiladas o anticuerpos monoclonales (MAbs) producidos por un hibridoma). En consecuencia, existe una demanda creciente de producción de estas proteínas en cultivos de células animales.

Sin embargo, en comparación con los cultivos de células bacterianas, los cultivos de células animales presentan tasas de producción más bajas y típicamente generan rendimientos de producción más bajos. El mantenimiento de concentraciones de glucosa en medios de cultivo celular a concentraciones bajas (por ejemplo de entre 0,02 y 1,0 g/l (por ejemplo de entre 0,11 y 5,5 mM)) y el cultivo de células en una fase de producción a una osmolalidad de entre aproximadamente 400 y 600 mOsm se ha encontrado que incrementa la producción de proteínas recombinantes por parte de cultivos de células animales, particularmente tras un cultivo inicial a una osmolalidad de entre aproximadamente 280 y 330 mOsm (patente US nº 5.856.179; cada patente US citada en el presente documento se incorpora como referencia en su totalidad) y en el que el cultivo en todas las fases también se realiza a una concentración de glutamina seleccionada (preferentemente de entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 2 mM; patente US nº 6.180.401).

Parte de dicho incremento de la producción de proteínas recombinantes puede resultar de una reducción de la producción de lactato que se produce al mantener las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo a niveles reducidos. Es conocido que el lactato es un fuerte inhibidor del crecimiento celular y de la producción de proteínas, y el mantenimiento de concentraciones reducidas de glucosa en el medio de cultivo puede resultar en niveles reducidos de producción de lactato (Glacken et al., Biotechnol. Bioeng. 28:1376-89, 1986; Kurokawa et al., Biotechnol. Bioeng. 44:95-103, 1994; patente US nº 6.156.50). En consecuencia, dependiendo de otras condiciones de cultivo, el mantenimiento de concentraciones de glucosa a niveles reducidos respecto a la densidad celular es un factor que puede contribuir a niveles más bajos de producción de lactato, y de esta manera a densidades celulares más altas y a una producción incrementada de proteínas recombinantes en cultivos de células animales.

Al exponer células a una concentración baja de glucosa en un medio, se altera su metabolismo de manera que tanto la tasa de incorporación de glucosa como la tasa de producción de lactato son más bajas en comparación con células mantenidas en procedimiento de alimentación por lotes que presentan medios con niveles altos de glucosa al inicio del procedimiento (patente US nº 6.156.570). Además, la duración del cultivo alimentado por lotes puede extenderse. En consecuencia, tanto la tasa de crecimiento celular como la tasa de producción de proteínas pueden mantenerse durante un periodo más largo en comparación con los cultivos alimentados por lotes, en los que las células se cultivan en un medio que conduce a niveles elevados de producción de lactato (por ejemplo en medio que contiene niveles elevados de glucosa al inicio del periodo de cultivo).

Una manera de controlar la producción de lactato por parte de las células en cultivo es mediante una alimentación invariante, de tasa constante, de glucosa en un procedimiento de alimentación por lotes (Ljunggren y Häggström, Biotechnol. Bioeng. 44:808-18, 1994; Häggström et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 782:40-52, 1996). Aunque dicha alimentación invariante de tasa constante de glucosa en un procedimiento de alimentación por lotes puede ayudar a controlar la producción de ácido láctico por parte de células en cultivo en niveles bajos, no se alcanzan las densidades celulares, tasas de crecimiento, niveles de viabilidad celular y tasas de producción de proteínas máximas, debido a que este método de proporcionar glucosa típicamente resulta en el agotamiento de la glucosa a medida que se incrementan las densidades celulares.

Otra manera de controlar la producción de lactato por parte de las células en cultivo a niveles reducidos es mediante la utilización de sistemas de administración de glucosa que se basan en el muestreo de cultivos a intervalos regulares. Se extraen muestras de un cultivo a intervalos regulares, y, tras determinar la concentración de glucosa en las muestras (por ejemplo mediante análisis de inyección de flujo, tal como en Male et al., Biotechnol. Bioeng. 55:497-504, 1997, o en Siegwart et al., Biotechnol. Prog. 15:608-16, 1999; o mediante cromatografía líquida de alta presión, tal como en Kurokawa et al., Biotechnol. Bioeng. 44:95-103, 1994), se añaden cantidades medidas de glucosa a los cultivos con el fin de mantener las concentraciones de glucosa en el medio a un nivel reducido sostenidamente respecto a la densidad celular. Sin embargo, las células pueden adaptarse a una concentración reducida de glucosa mediante, por ejemplo, el incremento de su capacidad de incorporar la glucosa, y producir de esta manera cantidades excesivas de ácido láctico a pesar de la baja concentración de la glucosa.

La patente WO nº 2004/048556 A1, que es técnica anterior según el art. 54(3) de EPC, da a conocer un método para el control de la producción de ácido láctico a niveles reducidos en un cultivo celular alimentado por lotes mediante la alimentación de glucosa de una manera restringida en el cultivo celular.

Además, el riesgo de contaminación por microorganismos mediante dichos métodos de control por retroalimentación basados en muestreos es significativa. En consecuencia, no resulta inesperado que la utilización de dichos métodos para la producción comercial de proteínas recombinantes en cultivos de células animales no haya demostrado ser factible. Los métodos de control por retroalimentación basados en muestreos para el mantenimiento de concentraciones bajas de glucosa en el medio de cultivo celular se han limitado a usos de investigación desde que se publicó el primer artículo sobre dichos métodos (Glacken et al., supra); el artículo informa de que las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo se determinaban mediante la utilización de un autoanalizador en línea, en el que se mezclaba una muestra que contenía glucosa con o-toluidina, y un colorímetro, con el que se medía la absorbancia a 660 nm de la mezcla para determinar la concentración de glucosa.

Por los motivos anteriormente indicados, existe una necesidad de métodos alternativos para controlar la producción de lactato por...

1. Método de cultivo celular para el control de la producción de ácido láctico a niveles reducidos en un cultivo celular alimentado por lotes, que comprende:

la mezcla de células animales y un medio con el fin de formar un cultivo celular, y

la alimentación de glucosa de una manera restringida al cultivo celular a una tasa que es una función de una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa por parte de las células animales cultivadas en un medio que contiene un nivel elevado de glucosa,

en el que la función es la multiplicación de la tasa esperada por un porcentaje inferior a 100%.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el porcentaje es por lo menos 33%.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el porcentaje no es superior a 45%.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la alimentación de glucosa de una manera restringida comprende la adición de uno o más bolos de alimentación de glucosa.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la alimentación de glucosa de una manera restringida se lleva a cabo sin muestreo de control por retroalimentación durante el cultivo.

6. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un sensor para el seguimiento de la densidad celular en el cultivo celular, y además se utiliza una medición derivada de un sensor de la densidad celular para calcular la tasa de alimentación de glucosa de una manera restringida en el cultivo celular.

7. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un sensor de pH para realizar un seguimiento del pH del cultivo celular y, en respuesta a un incremento por encima de un valor predeterminado de pH, se alimenta glucosa adicional de una manera restringida al cultivo celular.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la glucosa adicional alimentada de una manera restringida comprende uno o más bolos de alimentación de glucosa.

9. Método según la reivindicación 7, en el que el valor predeterminado de pH es aproximadamente 7.

10. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un sensor de pH para realizar un seguimiento del pH del cultivo celular y, en respuesta a un incremento por encima de un valor predeterminado de pH, la alimentación de glucosa de una manera restringida seguidamente continúa a una nueva tasa que es mayor que una tasa inmediatamente anterior.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la nueva tasa es superior en por lo menos 15% a la tasa inmediatamente anterior.

12. Método según la reivindicación 10, en el que la nueva tasa es superior en no más de 50% a la tasa inmediatamente anterior.

13. Método según la reivindicación 10, en el que la respuesta a un incremento por encima de un valor predeterminado de pH comprende además la adición de uno o más bolos de alimentación de glucosa al cultivo celular.

14. Método según la reivindicación 10, en el que el valor predeterminado de pH es aproximadamente 7.

15. Método según la reivindicación 1, en el que:

16. Método según la reivindicación 15, en el que la respuesta a un incremento por encima de un valor predeterminado de pH en (ii) y/o en (iii) comprende además la adición de uno o más bolos de alimentación de glucosa al cultivo celular.

17. Método según la reivindicación 15, en el que el valor predeterminado de pH es aproximadamente 7.

18. Método según la reivindicación 1, en el que la tasa premodelada se determina mediante:

la mezcla de células animales y un medio que contiene un nivel elevado de glucosa, para formar un primer cultivo celular, y

la determinación de una tasa de consumo de glucosa para las células animales cultivadas en el primer cultivo celular.

19. Método según la reivindicación 18, en el que se utiliza un sensor de pH para realizar un seguimiento del pH del segundo cultivo celular y, en respuesta a un incremento por encima de un valor predeterminado de pH, la alimentación de glucosa de una manera restringida comprende además la adición de uno o más bolos de alimentación de glucosa al segundo cultivo celular.

20. Método según la reivindicación 19, en el que la alimentación de glucosa de una manera restringida al segundo cultivo comprende además continuar seguidamente la alimentación a una nueva tasa que es superior a una tasa inmediatamente anterior.

21. Método según la reivindicación 19, en el que el valor predeterminado de pH es aproximadamente 7.

22. Método según la reivindicación 20, en el que la nueva tasa es superior en por lo menos 15% a la tasa inmediatamente anterior.

23. Método según la reivindicación 20, en el que la nueva tasa es superior en no más de 50% a la tasa inmediatamente anterior.

24. Método según la reivindicación 1, en el que la tasa premodelada se determina mediante:

la mezcla de células animales y un medio que contiene un nivel elevado de glucosa, para formar un primer cultivo celular,

la determinación de una tasa de consumo de glucosa par alas células animales cultivadas en el primer cultivo celular,

la mezcla de células animales y un medio con el fin de formar un segundo cultivo celular,

y la alimentación de glucosa de una manera restringida al segundo cultivo celular a una tasa que es una función de la tasa de consumo determinada de glucosa, en el que:

25. Método según la reivindicación 24, en el que la respuesta a un incremento por encima de un valor predeterminado de pH en (ii) y/o en (iii) comprende además la adición de uno o más bolos de alimentación de glucosa al segundo cultivo celular.