SE FRACCIONARON EXTRACTOS DE ESTOLONES BRUTOS MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO ANIONICO UTILIZANDO UN GRADIENTE EN ETAPAS.

UN PICO DE PROTEINAS QUE ELUIA A 10 % DE NACL Y QUE DEMOSTRO UNA INTENSA UNION A IGE SE ANALIZO MAS A FONDO MEDIANTE UN ANALISIS DE INMUNOTRANSFERENCIA/SDS - PAGE BIDIMENSIONAL. LA MAYORIA DE ESTA FRACCION ES UNA PROTEINA QUE PRESENTA UN PESO MOLECULAR DE 17 KD Y UN PI DE 5,2. LOS DATOS DE SECUENCIACION A PARTIR DEL EXTREMO N TERMINAL REVELARON LOS SIGUIENTES 9 AMINOACIDOS INICIALES: (*) - Q - Q - (*) - E - L - Q - D - L. BASANDOSE EN LA ACTIVIDAD DE UNION A IGE Y EN LA IDENTIDAD DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS NO CONOCIDA PARA OTROS ALERGENOS, ESTE ALERGENO SE DENOMINO ARA H II. EL ARA H II PUEDE UTILIZARSE PARA DETECTAR Y CUANTIFICAR ALERGENOS DEL CACAHUETE EN SUSTANCIAS ALIMENTARIAS. SE UTILIZO SUERO DE IGE PROCEDENTE DE PACIENTES CON REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD AL CACAHUETE DOCUMENTADA Y UN BANCO DE EXPRESION DE ADNC DE CACAHUETE PARA IDENTIFICAR CLONES QUECODIFICAN ALERGENOS DEL CACAHUETE. UNO DE LOS PRINCIPALES ALERGENOS DEL CACAHUETE, EL ARA H I, SE SELECCIONO A PARTIR DE ESTOS CLONES UTILIZANDO OLIGONUCLEOTIDOS ESPECIFICOS DE ARA H I Y LA TECNOLOGIA DE LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

Alérgenos de cacahuete y métodos.

Los cacahuetes están considerados como una de las comidas más alergénicas. La alergia del cacahuete, es un problema importante para la salud por la severidad de la reacción alérgica, la sensibilidad crónica de la alergia y la ubicuidad de los productos del cacahuete. Los individuos sensibles a los cacahuetes podrían experimentar síntomas que alcanzan desde una urticaria media a severa, y una anafilaxia¹ sistémica. En la anafilaxia fatal inducida por el alimento, los cacahuetes son la comida más frecuentemente implicada como causa de la reacción^{2, 3}. La sensibilidad a los cacahuetes a menudo aparece pronto en la vida y al contrario que en otras alergias a comidas, y tiende a persistir indefinidamente⁴.

Para dilucidar el mecanismo exacto de las reacciones lg-E, la identificación y purificación de los precisos alérgenos son necesarios. Información significante ha sido acumulada en alérgenos caracterizados desde una amplia variedad de fuentes, incluyendo polen, ácaro de polvo, caspa de animales e insectos⁵. En comparación, la caracterización de alérgenos para incluso los alérgenos de comida común, es menos definida. A pesar de la significante prevalencia de la hipersensibilidad de las reacciones al cacahuete y abundantes muertes al año, la identificación de los antigenos clínicamente relevantes y su entendimiento de la inmunobiología de la hipersensibilidad al cacahuete está solo empezando.

Los anticuerpos monoclonales son cada vez más utilizado para definir y caracterizar los epítopos alergénicos de muchos alérgenos. Múltiples alérgenos incluidos los alérgenos de ácaros del polvo, Der f I,⁶ y el alérgeno polen de gramíneas, LolpI,⁷ han sido estudiado por el uso de anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales murinos a estos alérgenos han demostrado ser bastante eficaz en la definición de sus epítopos alergénicos.

WO94 20614 describe los ácidos nucleicos que codifican las Der p VII y Der f alérgenos VII y el predice las secuencias de ácido amino. Péptidos con Der p VII y VII Der F actividad puede ser utilizado en el tratamiento o diagnóstico.

En este informe, hemos investigado la especificidad epítopo de Ara h II, el ⁸ de un alérgeno importante de cacahuete, mediante el uso de los anticuerpos monoclonales como sondas para el mapeo de los posibles factores determinantes antigénicos. Hemos producido y caracterizado un panel de anticuerpos monoclonales específicos de Ara h II. Los anticuerpos monoclonales h ARA II nos ha permitido definir por lo menos dos sitios antigénicos de Ara h II. Ensayos de inhibición se utilizaron para determinar los sitios de unión de IgE en Ara h II.

La invención se define en las reivindicaciones anexas.

Métodos

Pacientes con respuesta positiva al desafío del cacahuete.

Para la aprobación de este estudio fue obtenido por el Comité Consultivo Humanos de la Universidad de Arkansas de Ciencias Médicas. Doce pacientes con determatitis atópica y una respuesta positiva inmediata de la piel al pinchazo de prueba al cacahuete había una respuesta positiva a double-lind placebo-controlado al desafío alimentario (DBPCFC) o una historia convincente de anafilaxia de cacahuete (la reacción alérgica potencialmente mortal, es decir, con edema laríngeo, sibilancias severas, y/o hipotensión). Los detalles del procedimiento del desafío y la interpretación han sido previamente discutida.⁹ Cinco mililitros de la sangre venosa se extrajo de cada paciente y se permite que coagule, y el suero se recogió. Un volumen igual de suero de cada donante se mezcló para preparar una piscina de anticuerpo de cacahuete IgE específico.

Extracto crudo de cacahuete

De tres lotes comerciales de cacahuetes de los corredores del Sureste (Arachis hypogaea), de grado medio, a partir de cultivos de 1979 (North Carolina State University) se utilizaron en este estudio. Los cacahuetes fueron almacenados en el congelador a -18ºC hasta que se eran tostados. Los tres lotes se combinaron en proporciones iguales y se mezclan antes del desengrasado. El proceso de desengrase (desgrasado con hexano después del tueste de 13 a 16 minutos a 163ºC a 177ºC) se llevó a cabo en el laboratorio del Dr. Clyde Young (North Carolina State University). El cacahuete crudo fue extraído en 1 mol/L de NaCl, 20 mmol/L de sodio de fosfato (pH 7,0)1 y 8 mol/L de urea durante 4 horas a 4ºC. El extracto fue aclarado por centrifugación a 20.000 g durante 60 minutos a 4ºC. La determinación de proteínas totales se realizó por el método de ácido bicinconínico (Pierce Laboratorios, Rockville, Illinois).

Anticuerpos Monoclonales

Líneas celulares de ratón hibridomas fueron preparadas por selección estándar después de que la fusión celular de polietilenglicol mediada se llevó a cabo como ya se ha descrito. Las células del ratón/mieloma ¹⁰ SP²/0-AG¹⁴ se fundieron con esplenocitos inmunes a ratones hembra BALB/c hiperinmunizados con Ara h II. Las células sobrenadantes de hibridoma fueron examinados por ELISA y secante Western, y las líneas celulares fueron clonados por dilución limitante. Los anticuerpos secretados por las líneas de células monoclonales enhibridomas se isotipan de acuerdo con las instrucciones que se proporcionan (Tipo de exámen; Boehringer Mannhein, Indianapolis, Ind.). Líquidos ascíticos producidos en ratones BALB/c se purificó con la proteína G Superose, como se indica por el fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Los anticuerpos monoclonales fueron purificados en ensayos de inhibición de ELISA y ELISA.

ELISA para IgE

Una biotina-avidina ELISA fue desarrollada para cuantificar los anticuerpos anti-IgEde la proteína de cacahuete con las modificaciones de un ensayo descrito anteriormente¹¹. Las 2 filas superiores de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Gibco, Santa Clara, California) fueron recubiertos con película con 100 µl cada una de cantidades iguales (1 µg/ml) de anticuerpos humanos IgE anticuerpos monoclonales, 7.12 y 4.15 (amablemente proporcionada por el Dr. Andrew Saxon). El resto de la placa fue cubierta con la proteína de cacahuete en una concentración de 1 µg/ml en el recubrimiento de tampón (0,1 mol/L de carbonato de sodio, bicarbonato, pH 9,6). La placa se incubó a 37ºC durante 1 hora y luego se lava cinco veces con enjuague tampón (solución salina amortiguadora de fosfato, pH 7,4, con 0,05% de Tween 20, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) inmediatamente, y entre las incubaciones posteriores. Un segundo patrón de referencia de IgE se añadió a las 2 filas superiores para generar una curva de la IgE, que van desde 0,05 hasta 25 ng/ml.

El grupo de muestras de suero y suero del paciente se diluyó (1: 20 vol/vol) y se vació en pocillos individuales en la parte inferior de la placa. Después de incubar durante 1 hora a 37ºC y lavar, biotinilar, se añadió a todos los pocillos anti-IgE humana de cabra purificada por afinidad (KPL, Gaithersburg, Maryland) (1: 1000 vol/vol albúmina de suero bovino). Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se lavó, y 100 µl. de peroxidasa de rábano conjugado con avidina (Vector Laboratories, Burlingame, California) se añadió durante 5 minutos. Después del lavado, las placas fueron desarrolladas por la adición de un tampón de citrato que contiene 0-fenilendiamina (Sigma Chemical Co.). La reacción se detuvo por la adición de 100 µl. 2N de ácido clorhídrico a cada pocillo, y se leyó la absorbancia a 490 nm (Bio-Rad modelo del lector de microplacas 450; Bio-Rad Laboratorios de Diagnóstico Grupo, Hercules, California). La curva estándar se representa en una escala log-logit por medio de la regresión lineal simple análisis, y los valores para el suero en común y las muestras individuales se lee de la curva.^8,9

La inhibición de ELISA

La inhibición de ELISA fue desarrollado para examinar la especificidad local de los anticuerpos monoclonales generados a Ara h II. Un centenar de microlitros de proteína Ara II h (1 mg/ml) fue añadido a cada pozo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Gibco) en revestimiento protector (tampón carbonato, pH 9,6) durante 1 hora a 37ºC. A continuación, 100 µl de diferentes concentraciones (hasta 1000-doble exceso) de cada uno de los anticuerpos monoclonales fue añadido a cada pocillo durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar, una concentración estándar de la preparación biotinilada de anticuerpo monoclonal se añadió durante 1 hora a 37ºC. El ensayo se desarrolló mediante...

1. Un método de modificar la inmunogenicidad de un alérgeno que comprende la identificación de uno o más epítopos de unión de la IgE del alérgeno, y la mutación de uno o más epítopos de unión de la IgE para que la unión de la IgE en suero de los individuos con hipersensibilidad a uno o más epítopos de unión IgE se reduce o, la unión de la IgE en suero en individuos con hipersensibilidad al alérgeno es reducido, donde el alérgeno es un alérgeno alimentario y en el que sólo el 1 mutación de aminoácido se hace en uno o más epítopos de unión de la IgE.

2. El método de la reivindicación 1 donde el alérgeno es Ara h II.

3. El método de la reivindicación 2 en la que uno o más de los epítopos de unión de la IgE que está mutado e identificado en la SEQ. ID Nº 2.

4. El método de la reivindicación 1 donde el alérgeno es Ara h I.

5. El método de la reivindicación 4 en la que uno o más de los epítopos de unión de la IgE que está mutado e identificado en la SEQ. ID Nº 4.

6. Un alérgeno alterado por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la medicina.

7. El uso de un alérgeno alterado por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una persona alérgica en el que una cantidad efectiva del medicamento se administra para reducir una reacción alérgica a dicho alérgeno.