Ácido nucleico que comprende nucléotidos consecutivos que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima,

o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico, donde

(a) el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 3;

(b) el homólogo del polipéptido tiene por lo menos un 50 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 3;

(c) la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 50% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC ID NO: 1;

(d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 1;

(e) el ácido nucleico es un plásmido designado como plásmido 56TRCHisb1 depositado en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia con Número de acceso NM01/22400; o

(f) el ácido nucleico se hibrida al ácido nucleico definido en (d) o (e) bajos condiciones de hibridación astringentes

Ácidos nucleicos que codifican antígenos recombinantes de 56 y 82 kDa de gametocitos de Eimeria maxima y sus usos.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/303,699, solicitada el 6 de julio del 2001.

Antecedentes de la invención

Los organismos que causan la enfermedad conocida como "coccidiosis" en pollos pertenece a la phylum Apicomplexa, clase Sporozoa, subclase Coccidia, orden Eucoccidia, suborden Eimeriorina, familia Eimeriidae, género Eimeria. En el género Eimerian existen muchas especies, varias de ellas son patogénicas en los pollos. Las especies de mayor preocupación en la industria del pollo son Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix y Eimeria brunetti.

La coccidiosis se ha convertido en un problema económico importante en la industria del pollo a lo largo de las últimas décadas, debido principalmente al abarrotamiento de las granjas de pollos y el desarrollo de la resistencia a los fármacos por el parásito. La crianza de pollos bajo condiciones de abarrotamiento en un suelo sucio proporciona las condiciones óptimas para el crecimiento y la propagación de los parásitos de Eimeria. Bajo estas circunstancias, el control sanitario es imposible y el granjero debe confiar en la eficacia de los fármacos coccidiostáticos. Sin embargo, los fármacos deben mantenerse en el pienso todo el tiempo, deben utilizarse programas de de vaivén ("shuttle") para evitar la aparición de cepas de Eimeria de resistencia a los fármacos, y varios fármacos presentan efectos secundarios costosos. Además, estos coccidiostáticos presentan también efectos antibacterianos y, por tanto, se consideran que son antibióticos mezclados con el pienso. Recientemente, la Unión Europea ha decidido prohibir el uso de todos los antibióticos mezclados en el pienso en la industria del pollo, incluyendo los fármacos anticcocidiales. De este modo, la única estrategia viable para el control de la coccidiosis en el futuro es mediante el desarrollo de vacunas.

El parásito de Eimeria tiene un ciclo vital complejo en la mucosa del tracto intestinal. Este ciclo vital es muy similar al de otros parásitos hemosporidianos (es decir, plasmodium, babesia, etc.) a excepción de la falta de vector artrópodo. Los ooquistes se esporulan en el suelo sucio produciendo cuatro esporoquistes, cada uno conteniendo dos esporozoítos (que pertenecen por tanto la clase sporozoa). Los ooquistes son ingeridos por el pollo y se liberan los esporocitos mediante la molienda mecánica de la molleja. Los esporozoítos se liberan entonces de los esporocitos debido a la digestión de la pared de los esporocitos mediante enzimas proteolíticas en el intestino. A continuación, los esperozoítos móviles invaden los linfocitos y continúan con la invasión de células epiteliales donde empieza el ciclo asexual. El parásito continúa a través de 2-4 ciclos de replicación y división (cada especie teniendo un número definido de divisiones) que conducen a la producción de grandes cantidades de merozoítos hija. Después del ciclo final de la producción de merozoítos, empieza el ciclo sexual con la producción del macrogametocito (hembra) y el microgametocito (macho). El macrogametocito se caracteriza por la producción de cuerpos formadores de paredes, mientras que los microgametocitos contienen los componentes implicados en la formación de microgametos, que se desprenden de la superficie del parásito intracelular. Los microgametos están flagelados y son responsables de la fecundación del macrogameto. Se forma un zigoto que madura en el ooquiste mediante la fusión de los cuerpos formadores de paredes y la condensación del núcleo. Los ooquistes se secretan en las heces, completando así el ciclo.

Durante los últimos años, se han utilizado antígenos nativos de las etapas sexuales (gametocitos) de Eimeria maxima para inmunizar las gallinas ponedoras. Los pollitos vástagos se vacunaron consecuentemente a través de la inmunidad materna (anticuerpo materno protector). Se han identificado previamente tres antígenos protectores principales en los gametocitos de E. maxima que tiene los pesos moleculares de 250, 82 y 56 kDa (Patente EP No. 0 256 536, Patente de Estados Unidos No. 5,496,550, y la Patente de Estados Unidos No. 5,932,225). Se observó que estos antígenos están bien conservados entre las especies de Eimeria (Wallacj 1995) y pueden proteger contra las 3 principales especies que causan la coccidiosis en pollos tiernos: E. maxima, E. tenella y E. acervulina. Más recientemente, se observó que en pruebas en corrales, los pollitos de gallinas vacunadas con estos antígenos de gametocitos nativos se protegían contra Eimeria en condiciones campestres (Wallach 1996). Esta protección actúa para disminuir el máximo de eliminación de ooquistes hasta un nivel que no provoque ningún efecto dañino en la acción del pollo tierno. En base a los resultados anteriores, se concluyó que estos antígenos son eficaces con la coccidiosis en pollos y también tienen el potencial para utilizarse con la coccidiosis en otros animales domésticos incluyendo pavos, gansos, ovejas, ganado, cerdos y peces.

Estos tres antígenos también se caracterizaron a nivel molecular. Los experimentos de traducción libres de células se llevaron a acabo para identificar las moléculas de ARN que los codifican (Mencher et al.). Las moléculas de ADNc que codifican estos antígenos se clonaron mediante inmunocribado de una biblioteca de ADNc en el vector de expresión lambda zap (4, Patente de Estados Unidos No. 5,932,225). Mediante esta estrategia, se clonó y secuenció el gen que codifica el antígeno de 250 kDa. El clon pEM 250/14 se secuenció parcialmente en las patentes de Estados Unidos Nos 5,932,225 y 5,496,550. La figura 13a de la presente solicitud reproduce la figura 11 de las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,932,225 y 5,496,550, que representa la secuencia de ADN de los primeros 293 nucleótidos del clon pEM 250/14. La figura 13b de presente solicitud reproduce la figura 12 de las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,932,225 y 5,496,550, que muestra la secuencia de ADN de los últimos 196 nucleótidos del clon pEM 250/14. Además, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,932,225 y 5,496,550, se clonaron y secuenciaron los genes putativos que codifican los antígenos de 56 y 82 kDa.

Posteriormente, Fried et al. secuenciaron el clon pEM 250/14 completo y observaron que el antígeno tenía un peso molécula de 230 kDa en lugar de 250 kDa según se había pensado anteriormente. Fried et al. observaron que el gen de 230 kDa contiene motivos altamente repetitivos y que estas repeticiones están contenidas a lo largo de todo el gen (Fried et al.) Este clon se expresó en bacterias utilizando el vector plásmido pATH y se observó que es reconocido por suero de pollo convalescente extraído 14 días después de la infección con E. maxima. Finalmente, se observó que este gen se expresa únicamente en la etapa de gametocito macroEP y mediante inmunofluorescencia se observó que se localizaba en los cuerpos formadores de paredes del macrogameto (Fried et al.).

También se obtuvieron los clones de ADNc que codificaban los antígenos de 56 y 82 kDa mediante el cribado de la biblioteca con anticuerpos policlonales, así como un anticuerpo monoclonal contra el antígeno de 56 kDa. Se observó previamente que este anticuerpo monoclonal proporcionó una inmunidad pasiva para los pollos intactos (Wallach 1990). Se obtuvieron y analizaron unos cuantos clones. Se observó que uno de los clones codificaba un pequeño antígeno de 10 kDa y, por tanto, no era el clon deseado. Se observó que otro clon contenía sólo una pequeña parte del marco de lectura abierto (ORF) y mediante transferencia Northern se observó que se hibridaba con dos ARNms del tamaño aproximadamente esperado para los antígenos de 56 y 82 kDa. Se concluyó, por tanto, que éste era el clon deseado. A continuación, se cribaron las bibliotecas genómicas para obtener el clon de longitud completa. Sin embargo, debido a los motivos GCA altamente repetititvos en este clon, no fue posible aislar específicamente el clon de longitud completa. Los intentos por clonar la molécula de ADNc de longitud completa tampoco fueron exitosos debido a estas repeticiones. Finalmente, los intentos por expresar los clones de ADNc parcial en bacterias tampoco fueron exitosos probablemente debido a sus secuencias inusuales y no se obtuvo un nivel razonable de la expresión génica. Se ha observado previamente que los antígenos de 56 y 82 kDa están glicosilados (Patente de Estados Unidos...

1. Ácido nucleico que comprende nucléotidos consecutivos que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico, donde

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico es una molécula de ADN o una molécula de ARN.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la molécula de ADN es una molécula de ADNc.

4. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde los ácidos nucleicos consecutivos están unidos operativamente a un promotor de la transcripción de ARN.

5. Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Vector según la reivindicación 5, donde el vector es un plásmido.

7. Plásmido que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Plásmido según la reivindicación 7, designado como plásmido 56TRCHisb1 depositado en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia con Número de acceso NM01/22400.

9. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 5 ó 6.

10. Célula huésped según la reivindicación 9, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana; una célula vegetal; una célula de insecto, y una célula de mamífero.

11. Célula transformada aislada que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Célula transformada según la reivindicación 11, designada como clon de la bacteria 56TRCHisbl depositada en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia con Número de acceso NM01/22401.

13. Célula transformada según la reivindicación 11 ó 12, que comprende un polipéptido de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima, o un homólogo del polipéptido.

14. Método de producción de un polipéptido recombinante de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima, comprendiendo el método cultivar la célula transformada según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y aislar el polipéptido recombinante de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima.

15. Vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunette que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el plásmido según la reivindicación 6 ó 7.

16. Vacuna según la reivindicación 15, que comprende además un segundo ácido nucleico que codifica para un antígeno de Eimeria maxima, un plásmido que comprende dicho ácido nucleico, o un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico.

17. Vacuna según la reivindicación 16, donde el segundo ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 4, el plásmido comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 4, o el polipéptido es codificado por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 4.

18. Vacuna según la reivindicación 16, que comprende un antígeno de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 35 ó 42.

19. Vacuna según la reivindicación 16, que comprende un antígeno de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 37, 39, ó 41.

20. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 16-19, que comprende además un tercer antígeno.

21. Vacuna según la reivindicación 20, donde el tercer antígeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 26, un plásmido que comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 26, o el polipéptido codificado por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 26.

22. Vacuna según la reivindicación 20 ó 21, que comprende además un cuarto antígeno.

23. Vacuna según la reivindicación 22, donde el cuarto antígeno es un polipéptido de gametocitos de Eimeria maxima que tiene un peso molecular de 230 kDa a 270 kDa, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de gametocitos de Eimeria maxima que tiene un peso molecular de 230 kDa a 270 kDa, o un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de gametocitos de Eimeria maxima que tiene un peso molecular de 230 kDa a 270 kDa.

24. Vacuna según la reivindicación 22, donde el cuarto antígeno comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 29 en su extremo 5' o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 31 en su extremo 3'.

25. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24 para su uso en la inmunización de un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

26. Uso de una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 35 ó 42 o una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 37, 39 ó 41 para la preparación de una vacuna para inmunizar un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

27. Vacuna según la reivindicación 25, donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en ganado, ovejas, cerdos y peces.

28. Vacuna según la reivindicación 25, donde el sujeto es una especie aviar.

29. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 25, 27 ó 28, donde dicha vacuna se diseña para administrarse mediante la pulverización de dicha vacuna en las fosas nasales del sujeto.

30. Vacuna según la reivindicación 25 ó 28, donde la vacuna se diseña para administrarse in ovo.

31. Vacuna según la reivindicación 30, donde la vacuna se diseña para administrarse en la bolsa de aire de un huevo.

32. Uso según la reivindicación 26, donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en ganado, ovejas, cerdos y peces.

33. Uso según la reivindicación 26, donde el sujeto es una especie aviar.

34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26, 32 ó 33, donde dicha vacuna se diseña para administrarse mediante la pulverización de dicha vacuna en las fosas nasales del sujeto.

35. Uso según la reivindicación 26 ó 33, donde la vacuna se diseña para administrarse in ovo.

36. Uso según la reivindicación 35, donde la vacuna se diseña para administrarse en la bolsa de aire de un huevo.

37. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25 ó 28 a 31 para su uso para conferir a un sujeto recién nacido de una especie aviar inmunidad materna contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o para reducir la producción de ooquistes de Eimeria en heces de un sujeto recién nacido de una especie aviar, donde dicha vacuna se diseña para administrarse a la madre del sujeto en un tiempo adecuado anterior a la puesta de un huevo fecundado.

38. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 25, 27, 28 ó 37, donde la vacuna se diseña para administrarse mediante inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.

39. Huevo fecundado de una especie aviar que tiene una bolsa de aire, donde la bolsa de aire comprende la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 15-25, cuya vacuna es capaz de inducir antes o inmediatamente después de la incubación una respuesta inmune en un embrión contra una forma virulenta de Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

40. Huevo fecundado según la reivindicación 39, donde la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, pollos bántam, codornices y palomas.

41. Huevo fecundado según la reivindicación 40, donde la especie aviar es

un pollo.

42. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, ó 37, donde la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, pollos bántam, codornices y palomas.

43. Vacuna según la reivindicación 42, donde la especie aviar es un pollo.

44. Uso según la reivindicación 36, donde la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, pollos bántam, codornices y palomas.

45. Uso según la reivindicación 44, donde la especie aviar es un pollo.