Sistema para la selección específica de células y del estado de desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes no humanas, células germinales embrionarias no humanas y células madre adultas.

Método para obtener células diferenciadas o células madre que se diferencian en un tipo de célula específico, que comprende:

(a) introducir en células madre, excepto células madre embrionarias humanas, por lo menos uno o dos vectores que contienen secuencias de ADN que contienen la información para por lo menos un gen informador que codifica una proteína fluorescente que no daña las células y por lo menos un gen de resistencia;

en el que ambas secuencias de ADN se encuentran bajo el control del mismo promotor específico de célula y/o del desarrollo que está unido operativamente a dichos genes;

(b) cultivar las células en condiciones que permiten la diferenciación en el tipo de célula deseado;

(c) detectar la expresión de dicho gen informador;

(d) añadir un agente selectivo para la selección de aquellas células que expresan el gen informador y el gen de resistencia;

(e) obtener las células diferenciadas o diferenciantes que se desarrollan a partir de dichas células madre en un tipo de célula específico bajo el control del promotor específico de célula y/o desarrollo.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10005766.

Solicitante: AXIOGENESIS AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: NATTERMANNALLEE 1 GEBÄUDE S20 50829 KÖLN ALEMANIA.

Inventor/es: HESCHELER, JURGEN, BOHLEN, HERIBERT, FLEISCHMANN,BERND, KOLOSSOV,EUGEN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/85 (para células animales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/02 (en los que intervienen microorganismos vivos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES... > A61L27/00 (Materiales para prótesis o para revestimiento de prótesis (prótesis dentales A61C 13/00; forma o estructura de las prótesis A61F 2/00; empleo de preparaciones para la fabricación de dientes artificiales A61K 6/02; riñones artificiales A61M 1/14))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA;... > Cría u obtención de animales, no prevista en otro... > A01K67/027 (Nuevas razas de vertebrados)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen sustancias... > A61K35/12 (Sustancias procedentes de mamíferos; Composiciones que comprenden tejidos o células indeterminadas; Composiciones que comprenden células madre no embrionarias; Células modificadas genéticamente (células madre no caracterizadas A61K 35/545; vacunas o preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/15 (preparaciones medicinales)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen sustancias... > A61K35/54 (Ovarios; Ovocitos; Ovulos, célula huevo; Embriones; Células del feto; Células germinales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/071 (Células o tejidos de vertebrados, p.ej. células o tejidos humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/077 (Células mesenquimales, p. ej. Células óseas, células cartilaginosas, Células del estroma de la médula ósea, células adiposas o células musculares)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/0735 (Células madre embrionarias; Células germinales embrionarias)

PDF original: ES-2500917_T3.pdf

 

google+ twitter facebookPin it
Ilustración 1 de Sistema para la selección específica de células y del estado de desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes no humanas, células germinales embrionarias no humanas y células madre adultas.
Ilustración 2 de Sistema para la selección específica de células y del estado de desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes no humanas, células germinales embrionarias no humanas y células madre adultas.
Ilustración 3 de Sistema para la selección específica de células y del estado de desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes no humanas, células germinales embrionarias no humanas y células madre adultas.
Ilustración 4 de Sistema para la selección específica de células y del estado de desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes no humanas, células germinales embrionarias no humanas y células madre adultas.
Sistema para la selección específica de células y del estado de desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes no humanas, células germinales embrionarias no humanas y células madre adultas.

Fragmento de la descripción:

Sistema para la selección específica de células y del estado de desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes no humanas, células germinales embrionarias no humanas y células madre adultas 5

[0001] La presente invención se refiere a células madre embrionarias recombinantes, células de la línea germinal embrionaria y células madre adultas que contienen un gen para una proteína detectable que no daña la célula, así como un gen de resistencia, métodos para la preparación de las células, así como otras realizaciones.

[0002] La cardlomlogénesis de células madre embrionarias (ES) diferenciantes en cultivo se sugirió como una fuente ilimitada de células del músculo cardiaco para el transplante en sustitución de la terapia de tejido cardiaco dañado irreversiblemente (Klug et al., 1996). Uno de los obstáculos principales para la implementación práctica de esta estrategia es el rendimiento relativamente bajo de células del músculo cardiaco derivadas de ES diferenciadas, que constituyen normalmente no más de un 1-3% de la población global de células de ES diferenciantes (Muller M. y 15 col., 2000).

[0003] Además, las aún existentes células donantes ES no diferenciadas plantean una potencial amenaza para el receptor en las etapas posteriores de la diferenciación con respecto al desarrollo de tumores. Por lo tanto, el objetivo de desarrollar un método de selección eficaz y altamente específico es considerado como un hito en la

terapia celular de los trastornos cardiacos.

[0004] Ya se ha demostrado anteriormente que se puede seleccionar de manera satisfactoria una población enriquecida en células del músculo cardiaco a partir de células ES modificadas genéticamente que se transfectan de manera estable con un transgén de un gen con resistencia a fármacos de aminoglicósido-fosfato-transferasa (a-

MHC-Neo) controlado por un promotor a de la cadena pesada de la miosina del corazón (Klug et al., 1996). Este trabajo también mostró los potenciales problemas para el desarrollo de esta estrategia en un procedimiento eficaz a gran escala:

a) Se llevó a cabo el tratamiento con un fármaco selectivo (G418) en un cultivo adherente de células 30 ES diferenciantes, mientras que desde el punto de vista de la efectividad, así como la viabilidad

tecnológica, la estrategia óptima sería la aplicación del fármaco selectivo directamente sobre la suspensión de agregados de cuerpos embrioides (cuerpos embrioides = EB) - células ES (Wobus et al, 1991).

b) Los experimentos posteriores con respecto a la introducción de células seleccionadas

genéticamente en el corazón de animales receptores se convierten en significativamente más complicados por el trabajo para demostrar el destino de las introducciones en ausencia de marcadores de viabilidad específicos para células donantes.

[0005] El documento DE -A-19727962 describe células madre embrionarias de mamíferos no humanos que se transfectan de manera estable con una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína fluorescente que no daña a la célula, donde dicha secuencia de ADN se encuentra bajo el control de un promotor dependiente de la célula y/o del desarrollo (Kolosov et al, 1998). Dichas células ES recombinantes muestran las siguientes desventajas:

1. Aunque se puede disponer de tipos de células específicas in vivo con este método, no obstante, es difícil la purificación de estas células teñidas de manera vital. Por un lado, esto se puede explicar por el hecho de que las células de interés (por ejemplo, cardiomiocitos) representan sólo aproximadamente el 1-3% de las células generadas en EB. Por otro lado, los métodos de purificación de células (por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia, FACS) son perfectamente adecuados para células inmunológicas. En la purificación, sin embargo, de, por ejemplo, los cardiomiocitos, muchas células perecen o son dañadas irreversiblemente.

2. Además, resultó que con el método de purificación con higromicina en EB emplacados, las células

no resistentes a higromicina son difíciles de extraer incluso después de 7-14 días de la selección. A

pesar de la utilización de higromicina como marcador de selección de antemano, apareció una generación de tumores. Esto se aplica de manera similar a una selección con neomicina.

[0006] Un objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema nuevo para tanto la selección como la 60 extracción de células, respectivamente, a partir de un cultivo diferenciador de células madre embrionarias, células de

la línea germinal embrionarias y células madre adultas que evitan los problemas mencionados anteriormente. Como sistema se entiende una combinación de métodos de selección, células y utilización de las células y métodos particularmente en el campo médico, tal como se describe en la presente solicitud. Este objetivo se consigue mediante el método de la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas de la presente invención se describen en las 65 reivindicaciones después de la reivindicación 1.

[0007] Se describe un sistema para la selección específica de célula y/o el desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes, células de la línea germinal embrionaria y células madre adultas mediante la aplicación combinada de genes de resistencia (a fármacos) y genes informadores detectables bajo el control común de un promotor específico de célula y/o desarrollo. Sin embargo, las células madre embrionarias humanas y las células de

la línea germinal embrionaria humana, así como su uso en el método de la invención se excluyen explícitamente del alcance de la invención.

[0008] La presente invención se ¡lustra en primer lugar en general y posteriormente mediante ejemplos basados en la selección genética de células cardiacas de un cultivo diferenciante de células madre embrionarias que

se transfectan con dos tipos de vectores. Se enfatiza que la invención no se limita a estas realizaciones particulares, sino que es aplicable a los 3 tipos de células derivadas de la capa germinal, es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo y células derivadas de las mismas debido a la pluripotencia de las células madre y las células de la línea germinal, respectivamente. Un experto en la materia es capaz de variar la invención en el alcance de las reivindicaciones adjuntas teniendo en cuenta la siguiente descripción y su conocimiento general.

[0009] Según la presente invención, la información para por lo menos un gen de resistencia y para por lo menos un gen informador detectable que codifica una proteína fluorescente que no daña las células se introduce en las células madre embrionarias, las células de la línea germinal embrionaria y células madre adultas. La información para ambos genes puede estar disponible distribuida en uno o dos vectores. Lo importante es que la expresión del

gen para la proteína detectable, por ejemplo, fluorescente, así como para el gen de resistencia se encuentre bajo control de uno y el mismo promotor.

[0010] Según la presente invención, los promotores se seleccionan entre promotores específicos de células y promotores específicos del desarrollo. Los promotores específicos de células y tejidos, respectivamente, se refieren

a aquellos que son activos en poblaciones de células específicas y tejidos específicos, respectivamente. Según la presente invención, los promotores que se utilizan son activos en células del músculo cardiaco (cardiomiocitos).

[0011] Ejemplos adicionales para promotores específicos de tejido con aquellos, que son activos en células gliales, células hematopoyéticas, células neuronales,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para obtener células diferenciadas o células madre que se diferencian en un tipo de célula específico, que comprende:

(a) introducir en células madre, excepto células madre embrionarias humanas, por lo menos uno o dos vectores que contienen secuencias de ADN que contienen la información para por lo menos un gen informador que codifica una proteína fluorescente que no daña las células y por lo menos un gen de resistencia;

en el que ambas secuencias de ADN se encuentran bajo el control del mismo promotor específico de célula y/o del desarrollo que está unido operativamente a dichos genes;

(b) cultivar las células en condiciones que permiten la diferenciación en el tipo de célula deseado;

(c) detectar la expresión de dicho gen informador;

(d) añadir un agente selectivo para la selección de aquellas células que expresan el gen informador y el gen de resistencia;

(e) obtener las células diferenciadas o diferenciantes que se desarrollan a partir de dichas células madre en un tipo 15 de célula específico bajo el control del promotor específico de célula y/o desarrollo.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que las células diferenciadas son células de mamífero, preferiblemente de primate o roedores, particularmente de ratones, ratas o conejos o son de origen humano.

3. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína fluorescente que no daña las células se selecciona entre Proteína Verde Fluorescente (potenciada) (EGFP y GFP), Proteína Roja Fluorescente (RFP), Proteína Azul Fluorescente (BFP), Proteína Amarilla Fluorescente (YFP), y Proteína Cian Fluorescente (CFP), en particular preferiblemente GFP.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen de resistencia proporciona la resistencia contra un antibiótico de nucleósidos o un antibiótico de aminoglícósidos, preferiblemente una resistencia a puromocina.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el promotor es un promotor específico para 30 células mesodérmicas, preferiblemente células cardíacas, neuronas, células gliales, células hematopoyéticas, células endoteliales, células de músculo liso; células ectodérmicas, preferiblemente neuronas; células endodérmicas, preferiblemente células endoteliales; o en particular, preferiblemente, células de músculo esquelético, células de cartílago o fibroblastos.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor está unido a secuencias de ADN funcionales adicionales, en particular secuencias potenciadoras o secuencias represoras o secuencias IRES.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células se cultivan en una suspensión y/o como agregados celulares, preferiblemente en forma de cuerpos embrioides.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células contienen un gen de resistencia adicional para la selección de aquellas células que se transfectan de manera estable con una o dos construcciones de vectores, cuyo gen de resistencia es diferente del primer gen de resistencia, en el que preferiblemente la selección de aquellas células que contienen el vector comprende, antes de la etapa (b), añadir un agente selectivo

para seleccionar células transfectadas de manera estable.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se utiliza puromicina como agente selectivo para seleccionar aquellas células que expresan el gen informador y/o en el que las células seleccionadas se someten a clasificación celular para enriquecimientos adicionales.

10. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además obtener un cultivo celular.

11. Método para el análisis toxicológico de sustancias o el control del uso de un agente farmacéuticamente activo con las siguientes etapas:

(a) obtener un cultivo celular según la reivindicación 10;

(b) introducir sustancias en dicho cultivo celular, cuyos efectos tóxicos o no tóxicos o el uso como agente farmacéuticamente activo deben analizarse;

(c) analizar cuantitativa y/o cualitativamente la fluorescencia de las células obtenidas de este modo y comparar dichas células con las células que se cultivaron sin la sustancia a analizar.

12. Método para generar mamíferos quiméricos no humanos que muestran la expresión específica del tipo de célula y del tipo de desarrollo de un gen informador y un gen de resistencia que comprende:

(a) obtener células, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

(b) inyectar las células obtenidas en blastocitos de mamíferos no humanos; y 65 (c) transferir los blastocitos a madres sustitutas.