Procedimiento para la generación de líneas celulares proliferativas y que se diferencian.

Un procedimiento in vitro de estabilización de una línea celular de linfocitos B maduros,

que comprende las etapas de introducir un transductor de señal constitutivamente activo de una proteína de activación y transcripción (CA-STAT) en un linfocito B maduro; y mantener dicha célula en un entorno en el que se puede replicar; en el que dicha proteína STAT es STAT5, STAT5a o STAT5b.

Procedimiento para la generación de líneas celulares proliferativas y que se diferencian.

El campo de la presente invención es la producción y mantenimiento de líneas celulares, en especial líneas celulares a partir de células primarias, es decir, células no transformadas. En particular, pero no exclusivamente, la presente invención se refiere a materiales y procedimientos relacionados con la producción y mantenimiento de linfocitos B humanos productores de anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) son herramientas poderosas con utilidad demostrada en todos los campos de la investigación biomédica. La amplia mayoría de anticuerpos monoclonales producidos hasta hace poco han sido de origen de ratón. Sin embargo, la aplicación de estos mAb para propósitos terapéuticos en el hombre está dificultada por el hecho de que los seres humanos desarrollan rápidamente anticuerpos dirigidos contra Ig de ratón cuando se tratan con mAb de origen de ratón. Estas respuestas inmunitarias contra mAb de ratón disminuyen mucho su eficacia terapéutica. Por lo tanto, no es sorprendente que se hayan hecho muchos esfuerzos para desarrollar procedimientos que permiten la producción de anticuerpos monoclonales humanos para propósitos terapéuticos. Una estrategia para lograr este objetivo ha sido remodificar genéticamente anticuerpos murinos cambiando segmentos de gen constantes del anticuerpo murino por sus equivalentes humanos (Jones y col., 1986; Morrison y col., 1984) o más recientemente crear ratones que llevan genes de Ig humana (Fishwild y col., 1996; Mendez y col., 1997) . Otra es el uso de la presentación en fago para crear anticuerpos humanos (Hoogenboom y Chames, 2000; Winter y col., 1994) . Aunque el valor de estas tecnologías es indiscutible, sería muy conveniente desarrollar una tecnología para aislar linfocitos B productores de anticuerpos de seres humanos con una especificidad deseada.

Específicamente, el aislamiento de linfocitos B productores de anticuerpos de seres humanos que resolviera una exposición a patógenos con una eficacia alta o excepcional, ofrecería un medio para el aislamiento directo de mAb con eficacia probada en el marco clínico. Las estrategias basadas en hibridoma para lograr este objetivo se han visto obstaculizadas por los problemas de lograr fusiones estables de linfocitos B con líneas celulares de mieloma humano o de ratón, aunque recientemente se ha descrito una nueva línea celular de mieloma humano, que parece que es adecuada para la fusión estable con linfocitos B humanos (Karpas y col., 2001) . Como procedimiento alternativo se han inmortalizado linfocitos B productores de anticuerpos con el virus de Epstein Barr (EBV) . Sin embargo, estos intentos han tenido un éxito limitado. Aunque se ha establecido que los clones de EBV-LCL producen anticuerpos, las valoraciones son bajas y con frecuencia estas líneas no son estables (Roder y col., 1986) . Además, el EBV no transforma con preferencia células que producen anticuerpos.

Los linfocitos B humanos se pueden cultivar durante un periodo de tiempo limitado con CD40L y bien IL-4 sola o una combinación de IL-2 e IL-4 (Banchereau y col., 1991) . La IL-10 puede inducir más crecimiento de los linfocitos B cultivados y la diferenciación en linfocitos B altos productores de anticuerpos (Malisan y col., 1996) . Estos linfocitos B cultivados tienen una duración de vida replicativa limitada y después de 6 semanas, la mayoría de los linfocitos B han sufrido apoptosis, impidiendo la generación de líneas de linfocitos B humanos productores de anticuerpos.

Por lo tanto, en resumen, a pesar de los considerables esfuerzos, la generación de anticuerpos monoclonales humanos por fusión de estas células con células de mieloma humano o de ratón, ha sido muy difícil. Los intentos de generar valoraciones altas de linfocitos B transformados por EBV productores de anticuerpos también ha encontrado problemas considerables.

Los autores de la invención han ideado un procedimiento para establecer cultivos de larga duración de células de interés específico, en particular linfocitos B humanos productores de anticuerpos. Este procedimiento explota la capacidad de un mutante activo del transductor de señales de activación y transcripción (STAT) , en particular STAT5 (5b o 5a) , de conferir una duración de la vida replicativa prolongada.

STAT5b es activada por la IL-2 y probablemente tiene una función en el progreso del ciclo celular inducido por la IL-2 (Moriggl y col., 1999) . Los autores de la invención han encontrado sorprendentemente que la introducción de mutantes activos constitutivos (CA) de STAT5a o STAT5b (CA-STAT5a y CA-STAT5b respectivamente) en linfocitos B humanos permite el establecimiento de cultivos de larga duración de linfocitos B humanos. Los autores de la invención han encontrado que CA-STAT5b es particularmente eficaz en el establecimiento de cultivos de linfocitos B humanos de larga duración. Además, los autores de la invención han determinado que la expresión de BCL-6, que inhibe la diferenciación de los linfocitos de B de memoria en células plasmáticas (Reljic, 2000) , es regulada por STAT5b. Después de la introducción de un híbrido de CA-STAT5b con un receptor de estrógenos mutado, se obtienen líneas de linfocitos B de larga duración que proliferan en respuesta a CD40L, IL-2 e IL-4 de una forma dependiente del 4-hidroxitamoxifeno. Los autores de la invención demuestran además que los transcritos de BCL-6 son regulados por aumento por STAT5b-ER de una forma dependiente del hidroxitamoxifeno, en presencia de la ciclohexamida inhibidora de la síntesis de proteínas, indicando que BCL-6 es un objetivo directo de STAT5b. Por lo tanto, los datos ponen de manifiesto una nueva función de STAT5 en el control de la diferenciación de linfocitos B maduros.

Recientemente se ha mostrado que la introducción de BCL-6, que inhibe la diferenciación de linfocitos B de memoria en células plasmáticas (Reljic, 2000) , en linfocitos B de amígdala humana produce una prolongación considerable de la duración de la vida replicativa de estas células (Shvarts, 2002) . BCL-6 codifica un represor de la trascripción, que es activado con frecuencia por translocaciones cromosómicas en el linfoma de no Hodgking (Ye, 1993; Chang, 1996; Staudt, 1999; Shaffer, 2000) . Las translocaciones cromosómicas que implican a BCL- 6 afectan invariablemente solo al promotor y dejan el marco de lectura abierto de BCL-6 intacto. Por lo tanto, las translocaciones de BCL-6 en el linfoma de no Hodgkin contribuyen a la oncogénesis por desregulación de la expresión de la proteína BCL-6 natural. BCL-6 es necesaria para el desarrollo normal de linfocitos B y T (Ye, 1997) . Se cree que BCl-6 funciona principalmente en la diferenciación de linfocitos y en la regulación de la respuesta inmunitaria. Esto se basa en la implicación de BCL-6 en el linfoma de no Hodgkin, el defecto en la formación del centro germinal de ratones que no expresan BCL-6 (Dent, 1997; Fukuda, 1997; Ye, 1997) y el descubrimiento de que BCL-6 regula una serie de genes implicados en la fisiología de los linfocitos (Ye, 1997; Shaffer, 2000) . Recientemente Fearon y colaboradores demostraron que BCL-6 previene la diferenciación terminal del centro germinal y linfocitos B de memoria, previniendo de esta forma la detención del ciclo celular (Reljic, 2000; Fearon, 2001) . Por lo tanto, el descubrimiento de que la expresión de BCL-6 en linfocitos B humanos cultivados produce una prolongación considerable de la duración de la vida de estas células (Shvarts, 2002) está de acuerdo con la idea de que la diferenciación terminal es responsable de la duración de la vida relativamente corta de los linfocitos B cultivados con CD40L y citoquinas. Dada la importante función de BCL-6 en la regulación de la diferenciación y crecimiento de linfocitos B, la cuestión de cómo es regulado este gen tiene un gran interés. El examen del promotor de BCL-6 puso de manifiesto la presencia de dos sitios de unión de STAT5 (Ohashi, 1995) , dando la idea a los autores de la invención de que STAT5 puede regular la expresión de BCL-6.

En el presente documento se describen procedimientos de mantenimiento de una línea celular mediante prolongación de la duración de la vida replicativa de las células, hasta el momento en el que se requiera que la célula se diferencie, produciendo de esta forma un producto expresado deseado, p. ej., una proteína, enzima o anticuerpo.

En un primer aspecto, se proporciona un procedimiento in vitro para estabilizar una línea celular de linfocitos B maduros, que comprende las etapas de introducir una proteína STAT... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro de estabilización de una línea celular de linfocitos B maduros, que comprende las etapas de introducir un transductor de señal constitutivamente activo de una proteína de activación y transcripción (CA-STAT) en un linfocito B maduro; y mantener dicha célula en un entorno en el que se puede replicar; en el que dicha proteína STAT es STAT5, STAT5a o STAT5b.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el entorno comprende uno cualquiera o más de la IL-2, CD40L e IL-4.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la proteína CA-STAT5 se introduce en la célula por transducción.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína CA-STAT está unida a un agente inactivante que tiene un estado conectado y un estado desconectado, en el que la célula se mantiene con el agente inactivante en el estado desconectado.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el agente inactivante es un sistema promotor/de escisión inducible, ácido nucleico de sentido contrario, o una proteína que se asocia con STAT5 como una proteína de fusión.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el sistema promotor/de escisión inducible es el sistema de escisión cre-lox o FLP/FRT.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico de sentido contrario es ARNi.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la proteína asociada forma una proteína de fusión con CA-STAT y se puede inactivar por un cambio en el entorno.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la proteína asociada es una molécula receptora.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la proteína asociada es un receptor de estrógenos.

11. Un procedimiento in vitro de inducción de diferenciación terminal en un linfocito B, que se ha estabilizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10; que comprende conectar dicho agente inactivante haciendo así la proteína STAT5 inactiva e induciendo la diferenciación terminal.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, que además comprende la etapa de extraer un producto de expresión de una célula terminalmente diferenciada.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el producto de expresión es una molécula de ácido nucleico.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el producto de expresión es una proteína.

15. Un procedimiento in vitro para producir una línea celular de linfocitos B maduros, comprendiendo dichos procedimiento las etapas de

(a) incorporar en un linfocito B maduro una proteína CA-STAT5 en asociación con un agente inactivante;

(b) dejar que dichas células se repliquen desconectando dicho agente inactivante, haciendo así activa la CA-STAT5; y

(c) mantener dicha línea celular producida.

16. Un procedimiento para inducir la diferenciación terminal en un linfocito B, que comprende

(a) obtener una célula de una línea de linfocitos B producida de acuerdo con la reivindicación 15;

(b) inducir la diferenciación terminal de dicha célula conectando dicho agente inactivante, haciendo así inactiva la proteína STAT5; y

(c) extraer un producto de expresión deseado de la célula terminalmente diferenciada.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el producto de expresión es una

proteína.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el producto de expresión es una secuencia de ácido nucleico.

19. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que las células son 5 linfocitos B humanos productores de anticuerpos.

20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el producto de expresión es un anticuerpo Ig.

21. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que CA-STAT5 es STAT5a o STAT5b.