Peptidomiméticos de horquilla beta como antagonistas de CXCR4.

Compuesto peptídico de cadena principal ciclada, construido a partir de 16 residuos de aminoácido, de fórmula

ciclo

(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) (I),

en la que

Xaa3 es Ala, Tyr o Tyr(Me),

Tyr(Me) es ácido (2S)-2-amino-(4-metoxifenil)-3-propiónico,

Xaa7 es DTyr, DTyr(Me) o DPro,

DTyr(Me) es ácido (2R)-2-amino-(4-metoxifenil)-3-propiónico, o

Xaa8 es Dab; u Orn(iPr),

Dab es ácido (2S)-2,4-diaminobutírico,

Orn(iPr) es ácido (2S)-Nω-isopropil-2,5-diaminopentanoico,

Xaa13 es Gln; o Glu,

Xaa14 es Lys(iPr),

Lys(iPr) es ácido (2S)-Nω-isopropil-2,6-diaminohexanoico,

todos los residuos de aminoácidos que no se designan explícitamente como residuos de D-aminoácidos son residuos de L-aminoácidos, y

los dos grupos -SH de los dos residuos de cisteína Cys4 y Cys11 están reemplazados por un grupo -S-S-, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2012/060763.

Solicitante: Polyphor AG.

Inventor/es: OBRECHT, DANIEL, GOMBERT, FRANK, OTTO, ZIMMERMANN, JOHANN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/04 (Péptidos que tienen hasta 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados (gastrinas A61K 38/16, somatostatinas A61K 38/31, melanotropinas A61K 38/34))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia... > C07K7/64 (Péptidos cíclicos que contienen solamente enlaces peptídicos normales)
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Peptidomiméticos de horquilla beta como antagonistas de CXCR4.

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DESCRIPCIÓN

Peptidomiméticos de horquilla beta como antagonistas de CXCR4 La presente invención da a conocer peptidomiméticos de horquilla β que tienen actividad antagonista de CXCR4 y están englobados en la divulgación general de los documentos WO2004/096840 A1 y WO 2010/060479, pero no se dan a conocer de forma específica en los mismos.

Los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención son ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8- Arg9-Tyr10-Cys-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, con Xaa3 que es Ala, Tyr o Tyr(Me), tal como se describe en el presente documento a continuación, Xaa7 que es DTyr, DTyr(Me), tal como se describe en el presente documento a continuación o DPro, Xaa8 que son Dab u Orn(iPr), tal como se describe en el presente documento a continuación, Xaa13 que es Gln o Glu y Xaa14 que es Lys(iPr), tal como se describe en el presente documento a continuación.

Además, la presente invención da a conocer un procedimiento de síntesis eficiente mediante el cual, si se desea, estos compuestos se pueden preparar en formato de biblioteca en paralelo. Estos peptidomiméticos de horquilla β tienen propiedades farmacológicas favorables y, además, muestran una unión adecuada a proteínas plasmáticas y velocidades de eliminación adecuadas. Por lo tanto, se pueden utilizar como ingredientes activos en cantidades bajas para todo tipo de formulaciones de fármacos, en particular para formulaciones de fármacos de liberación prolongada.

Muchos procedimientos biológicos médicamente significativos están mediados por transducción de señales, que implica, en general, quimiocinas y sus receptores y, en particular, el factor 1 derivado del estroma (SDF-1/CXCL12) y su receptor CXCR4.

El CXCR4 y su ligando, el SDF-1 están involucrados en el tráfico de las células B, las células madre hematopoyéticas (HSC) y las células progenitoras hematopoyéticas (HPC). Por ejemplo, el CXCR4 se expresa en células CD34+ y está implicado en el procedimiento de migración y retorno celular de CD34+ (S.M. Watt, S.P. Forde, Vox sanguinis 2008, 94, 18-32). También se ha demostrado que el receptor CXCR4 desempeña un papel importante en la liberación de células madre y progenitoras de la médula ósea a la sangre periférica (L.M. Pelus, S. Fukuda, Leukemia 2008, 22, 466-473). Esta actividad del CXCR4 podría ser muy importante para las recolecciones por aféresis eficaces de células madre de sangre periférica. Las células de sangre periférica autólogas proporcionan una recuperación hematopoyética rápida y sostenida después de un autotrasplante, después de la administración de altas dosis de quimioterapia o radioterapia en pacientes con neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos (W.C. Liles y otros, Blood 2003, 102, 2728-2730).

Recientemente, se ha demostrado que el SDF-1 está aumentado localmente en modelos animales de lesión entre los que se incluyen apoplejía focal isquémica, isquemia cerebral global, infarto de miocardio e isquemia de extremidades posteriores, así como que está involucrado en la recuperación después de una isquemia periférica o después de una lesión del hígado, riñón o pulmón (A.E. Ting, R.W. Mays, M.R. Frey, W. Van’t Hof, S. Medicetty, R. Deans, Critical Reviews in Oncology/Hematology 2008, 65, 81-93 y literatura citada en la misma; F. Lin, K. Cordes, L. Li, L. Hood, W.G. Couser, S.J. Shankland y otros, J. Am. Soc. Nephrol. 2003, 14, 1188-1199; C.C. Dos Santos, Intensive Care Med. 2008, 34, 619-630). Estos resultados sugieren que el SDF-1 puede ser un quimioatrayente para las células madre positivas a CXCR4 para la reparación/regeneración de órganos y tejidos (M.Z. Ratajczak, M. Kucia, R. Reca, M. Majka, A. Janowska-Wieczorek, J. Ratajczak, Leukemia 2004, 18, 29-40). Por lo tanto, la modulación del eje SDF-1/CXCR4 mediante inhibidores del CXCR4 debería dar como resultado un beneficio terapéutico significativo mediante la utilización de células madre liberadas para regular la reparación de tejidos.

Más recientemente, se ha demostrado que la interrupción del eje CXCR4/SDF-1 mediante inhibidores de CXCR4 desempeña un papel crucial en la movilización diferencial de las células progenitoras como HPC, células progenitoras endoteliales (EPC) y estromales (CCP) de la médula ósea (S.C. Pitchford, R.C. Furze, C.P. Jones, A.M. Wegner, S.M. Rankin, Cell Stem Cell 2009, 4, 62). Además, células muy pequeñas similares a las embrionarias (VSEL) CXCR4+ derivadas de médula ósea se movilizaron en pacientes con infarto agudo de miocardio, lo que indica un hipotético mecanismo reparador (W. Wojakowski, M. Tendra, M. Kucia, E. Zuba-Surma, E. Paczkowska, J. Ciosek, M. Halasa, M. Król, M. Kazmierski, P. Buszman, A. Ochala, J. Ratajczak, B. Machalinski, M. Z. Ratajczak, J. Am. Coll. Cardiol. 2009, 53, 1). Estos hallazgos pueden ser explotados para proporcionar terapias de células madre eficaces para la regeneración de tejidos.

Las células madre mesenquimales (MSC) son células no hematopoyéticas progenitoras que tienen la capacidad de diferenciarse en tejidos tales como hueso y cartílago (D. J. Prockop, Science 1997, 276, 71). Dado que una pequeña proporción de MSC expresa fuertemente CXCR4 funcionalmente activo, la modulación del eje CXCR4/SDF-1 puede mediar la migración y el direccionamiento específicos de estas células (R.F. Wynn, C.A. Hart, C. Corradi-Perini, L. O’Neill, C.A. Evans, J.E. Wraith, L.J. Fairbaim, I. Bellantuono, Blood 2004, 104, 2643).

Cada vez hay más evidencias que sugieren que las quimiocinas en general y la interacción SDF-1/CXCR4 en particular desempeñan un papel fundamental en la angiogénesis. Las quimiocinas inducen la angiogénesis directamente mediante la unión a sus receptores afines en las células endoteliales o indirectamente mediante la promoción de infiltrados de células inflamatorias, que ofrecen otros estímulos angiogénicos. Se ha demostrado que una serie de quimiocinas proinflamatorias, incluyendo la interleucina 8 (IL-8), el oncogén regulado por el crecimiento, el factor 1 derivado de células estromales (SDF-1), la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), la eotaxina 1 y la I-309 actúan como inductores directos de la angiogénesis (X. Chen, J.A. Beutler, T.G. McCloud, A. Loehfelm, L. Yang, H.F. Dong, O.Y. Chertov, R. Salcedo, J.J. Oppenheim, O.M. Howard. Clin. Cancer Res. 2003, 9(8), 3115- 3123; R. Salcedo, J.J. Oppenheim, Microcirculation 2003, (3-4), 359-370).

Los resultados obtenidos recientemente muestran que el receptor CXCR4 está implicado en la actividad quimiotáctica de las células cancerígenas, tales como en la metástasis de cáncer de mama o en la metástasis de cáncer de ovario (A. Muller, B. Homey, H. Soto, N. Ge, D. Catron, M.E. Buchanan, T. McClanahan, E. Murphey, W. Yuan, S.N. Wagner, J.L. Barrera, A. Mohar, E. Verastegui, A. Zlotnik, Nature 2001, 50, 410; J.M. Hall, K.S. Koraj, Molecular Endocrinology 2003, 17, 792-803), el linfoma no Hodgin (F. Bertolini, C. Dell'Agnola, P. Manusco, C. Rabascio, A. Burlini, S. Monestiroli, A. Gobbi, G. Pruneri, G. Martinelli, Cancer Research 2002, 62, 3.106-3112), o el cáncer de pulmón (T. Kijima, G. Maulik, P.C. Ma, E.V. Tibaldi, R.E.Turner, B. Rollins, M. Sattler, B.E. Johnson, R. Salgia, Cancer Research 2002, 62, 6304-6311), el melanoma, el cáncer de próstata, el cáncer de riñón, el neuroblastoma, el cáncer pancreático, el mieloma múltiple, la leucemia linfocítica crónica, el carcinoma hepatocelular, el carcinoma colorrectal, el cáncer de endometrio y el tumor de células germinales (H. Tamamura y otros, FEBS Letters 2003, 550, 79-83, referencias citadas; Z. Wang, Q. Ma, P. Liu, H. Yu, L. Zhao, S. Shen, J. Yao, British Journal of Cancer 2008, 99, 1695; B. Sung, S. Jhurani, K. S. Ahn, Y. Mastuo, T. Yi, S. Guha, M. Liu, B. Aggarwal, Cancer Res. 2008, 68, 8938; H. Liu, Z. Pan, A. Li, S. Fu, Y. Lei, H. Sol, M. Wu, W. Zhou, Celular and Molecular Immunology, 2008, 5, 373; C. Rubie, O. Kollmar, V.O. Frick, M. Wagner, B. Brittner, S. Gräber, M.K.

Schilling, Scandinavian Journal of Immunology 2008, 68, 635; S. Gelmini, M. Mangoni, F. Castiglioe, C. Beltrami, A. Pieralli, K.L. Andersson, M. Fambrini, G.I. Taddie, M. Serio, C. Orlando, Clin. Exp. Metastasis 2009, 26, 261; D.C. Gilbert, I. Chandler, A. McIntyre, N.C. Goddard, R. Gabe, R.A. Huddart, J. Shipley, J. Pathol. 2009, 217, 94). El bloqueo de la actividad quimiotáctica con un inhibidor del CXCR4 debería detener la migración de las células cancerosas y, por lo tanto, la metástasis.

El CXCR4 ha sido implicado además en el crecimiento y la proliferación de tumores sólidos y leucemia/linfoma. Se demostró que la activación del receptor CXCR4 era crítica para el crecimiento de tumores neuronales y gliales malignos. Además, la administración sistémica del antagonista de CXCR4 AMD3100 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de glioblastoma y de meduloblastoma intracraneales mediante el aumento de la apoptosis y la disminución de la proliferación de células tumorales (J.B. Rubin, A. L Kung, R. Klein S, J.A. Chan, Y. Sun, K. Schmidt, M.W Kieran, A.D. Luster, R.A. Segal, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2003, 100 (23), 13513-13518; S. Barbero, R. Bonavia, A. Bajetto, C. Porcile, P. Pirani, J.L. Ravetti, G.L. Zona, R. Spaziante, T. Florio, G. Schettini, Cancer Res. 2003, 63(8), 1969-1974; T. Kijima, G. Maulik, P.C. Ma, E.V Tibaldi, R.E. Turner, B. Rollins, M. Sattler, B.E. Johnson, R. Salgia. Cancer Res. 2002, 62 (21), 6304-6311). Los inhibidores del CXCR4 mostraron además eficacias prometedoras in vitro e in vivo en el cáncer de mama, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer pancreático, el cáncer gástrico, el cáncer colorrectal, el melanoma maligno, el cáncer de ovario, el rabdomiosarcoma, el cáncer de próstata, así como la leucemia linfocítica crónica, la leucemia mielógena aguda, la leucemia linfoblástica aguda, el mieloma múltiple y el linfoma no Hodgkin (J.A. Burger, A. Peled, Leukemia 2009, 23, 43-52 y la literatura citada en este documento).

Está bien establecido que las quimiocinas están involucradas en una serie de patologías inflamatorias y algunas de ellas muestran un papel fundamental en la modulación del desarrollo de los osteoclastos. La inmunotinción para SDF-1 (CXCL12) en biopsias de tejido óseo y sinovial tanto de muestras de artritis reumatoide (AR) como de osteoartritis (OA) han revelado fuertes aumentos en los niveles de expresión de las quimiocinas en condiciones inflamatorias (F. Grassi, S. Cristino, S. Toneguzzi, A. Piacentini, A. Facchini, G. Lisignoli, J. Cell Physiol. 2004; 199 (2), 244-251). Parece probable que el receptor CXCR4 desempeñe un papel importante en las enfermedades inflamatorias, tales como la artritis reumatoide, el asma, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, aterosclerosis, o enfermedades oculares, tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad (K.R. Shadidi y otros, Scandinavian Journal of Immunology 2003, 57, 192-198; J.A.

Gonzalo, J. Immunol. 2000, 165, 499-508; S. Hatse y otros, FEBS Letters 2002, 527, 255-262 y las referencias citadas, A.T. Weeraratna, A. Kalehua, I. DeLeon, D. Bertak, G. Maher, M.S. Wade, A. Lustig, K.G. Becker, W. Wood, D. G. Walker, T.G. Beach, D.D. Taub, Exp. Cell Res. 2007, 313, 450; M. Shimoji, F. Pagán, E.B. Healton, I. Mocchetti, Neurotox. Res. 2009, 16, 318; A. Zernecke, E. Shagdarsuren, C. Weber, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 1897; R. Lima e Silva, J. Shen, S.F. Hackett, S. Kachi, H. Akiyama y otros, FASEB 2007, 21, 3219). La mediación del reclutamiento de células inmunes a sitios de inflamación debería ser detenida por un inhibidor de CXCR4.

Hasta la fecha, las terapias disponibles para el tratamiento de las infecciones por VIH han conducido a una notable mejora en los síntomas y a la recuperación de la enfermedad de las personas infectadas. Aunque la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), que comprende una combinación de inhibidores de la transcriptasa inversa/proteasa, ha mejorado mucho el tratamiento clínico de los individuos con SIDA o infección por el VIH, todavía se mantienen varios problemas graves, tales como la resistencia múltiple a fármacos, efectos adversos significativos y unos costes elevados. Particularmente deseados son los agentes anti-VIH que bloquean la infección por VIH en una etapa temprana de la infección, tal como la entrada viral. Recientemente se ha descubierto que, para una entrada eficiente en las células diana, los virus de inmunodeficiencia humana requieren los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4, así como el receptor primario CD4 (N. Levy, Engl. J. Med. 1996, 335, 1528-1530). Por consiguiente, un agente que pueda bloquear los receptores de quimiocinas CXCR4 debería prevenir infecciones en individuos sanos y frenar o detener la progresión viral en pacientes infectados (J. Cohen, Science 1997, 275, 1261- 64).

Entre los diferentes tipos de inhibidores de CXCR4 (M. Schwarz, T.N.C. Wells, A.E.I. Proudfoot, Receptors and Channels 2001, 7, 417-428; Y. Lavrovsky, Y.A. Ivanenkov, K.V. Balakin, D.A. Medvedewa, P.V. Ivachtchenko, Mini Rev. Med. Chem. 2008, 11, 1075-1087), una clase emergente se basa en análogos de péptidos de origen natural catiónicos derivados de polifemusina II que tienen una estructura de hoja β antiparalela, y una horquilla β que se mantiene por dos puentes disulfuro (H. Nakashima, M. Masuda, T. Murakami, Y. Koyanagi, A. Matsumoto, N. Fujii, N. Yamamoto, Antimicrobial Agents and Chemoth. 1992, 36, 1249-1255; H. Tamamura, M. Kuroda, M. Masuda, A. Otaka, S. Funakoshi, H. Nakashima, N. Yamamoto, M. Waki, A. Matsumotu, JM Lancelin, D. Kohda, S. Tate, F. Inagaki, N. Fujii, Biochim. Biophys. Acta 1993, 209, 1163; el documento WO 95/10534 A1).

La síntesis de análogos estructurales y los estudios estructurales por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) han demostrado que los péptidos catiónicos adoptan conformaciones de horquilla β bien definidas, debido al efecto de restricción de uno o dos puentes disulfuro (H. Tamamura, M. Sugioka, Y. Odagaki, A. Omagari, Y. Kahn, S. Oishi, H. Nakashima, N. Yamamoto, S. C. Peiper, N. Hamanaka, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 359-362). Estos resultados muestran que la estructura en forma de horquilla β desempeña un papel importante en la actividad antagonista de CXCR4.

Otros estudios estructurales han indicado que la actividad antagonista puede ser influenciada además por la modulación de la estructura anfifílica y el farmacóforo (H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, K. Gotoh, T. Kanamoto, Y. Xu, E. Kodama, M. Matsuoka, T. Hattori, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1897-1902; H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, S. Oishi, H. Habashita, T. Kanamoto, K.

Gotoh, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 1417-1426; H. Tamamura, K. Hiramatsu, K. Miyamoto, A. Omagari, S. Oishi, H. Nakashima, N. Yamamoto, Y. Kuroda, T. Nakagawa, A. Otaki, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Letters 2002, 12, 923-928).

Los compuestos ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, de la presente invención son peptidomiméticos de horquilla β cíclicos que exhiben una actividad antagonista de CXCR4 elevada, que son útiles para las recolecciones aféresis por eficaces de células madre de sangre periférica movilizadas y/o la utilización de estas células movilizadas para regular la reparación de tejido, y/o que tienen actividad anticancerígena, actividad antiinflamatoria y/o actividad anti-VIH.

La conformación de horquilla β cíclica está inducida por el residuo de D-aminoácido Xaa7 y el residuo de D- aminoácido DPro15. Se consigue una estabilización adicional de la conformación de horquilla mediante los residuos de aminoácidos Cys de las posiciones 4 y 11, que tomados conjuntamente, forman un enlace disulfuro.

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que la introducción del residuo de aminoácido básico Lys(iPr) en la posición 14, apoyada por la introducción opcional de Orn(iPr) en la posición 8 de ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3- Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, da como resultado peptidomiméticos de horquilla β que tienen propiedades farmacológicas favorables. Estas propiedades, junto con una unión adecuada a las proteínas del plasma y velocidades de eliminación apropiadas conforman un perfil farmacológico que permite a estos compuestos ser utilizados como ingredientes activos en cantidades bajas para todo tipo de formulaciones de fármacos, en particular formulaciones de fármacos de liberación prolongada.

Los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención son compuestos de fórmula general ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) (I), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que Xaa3 es Ala, Tyr o Tyr(Me), siendo este último ácido (2S)-2-amino-(4-metoxifenil)-3-propiónico, Xaa7 es DTyr, DTyr(Me), es decir, ácido (2R)-2-amino-(4-metoxifenil)-3-propiónico, o DPro, Xaa8 es Dab, es decir, ácido (2S)-2,4-diaminobutírico, u Orn(iPr), es decir, ácido (2S)-Nω-isopropil-2,5- diaminopentanoico, Xaa13 es Gln o Glu, Xaa14 es Lys(iPr), es decir, ácido (2S)-Nω-isopropil-2,6-diaminohexanoico.

En una realización particular de la presente invención, los peptidomiméticos de horquilla β son compuestos de fórmula general I, en la que Xaa13 es Gln, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra realización particular de la presente invención, los peptidomiméticos de horquilla β son compuestos de fórmula general I, en la que Xaa3 es Tyr; o Tyr(Me), Xaa7 es DPro, Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una realización preferente de la presente invención, el compuesto es ciclo(-Tyr1-His2-Ala3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr7- Dab8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En otra realización preferente de la presente invención, el compuesto es ciclo(-Tyr1-His2-Tyr3-Cys4-Ser5-Ala6-DPro7- Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En otra realización preferente de la presente invención, el compuesto es ciclo(-Tyr1-His2-Tyr(Me)3-Cys4-Ser5-Ala6- DPro7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En otra realización preferente de la presente invención, el compuesto es ciclo(-Tyr1-His2-Ala3-Cys4-Ser5-Ala6- DTyr(Me)7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En otra realización preferente de la presente invención, el compuesto es ciclo(-Tyr1-His2-Tyr3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr7- Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En aún otra realización preferente de la presente invención, el compuesto es ciclo(-Tyr1-His2-Tyr(Me)3-Cys4-Ser5- Ala6-DTyr(Me)7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

De acuerdo con la presente invención, estos peptidomiméticos de horquilla β se pueden preparar mediante un procedimiento que comprende (a) acoplar un soporte sólido apropiadamente funcionalizado con un derivado protegido apropiadamente en N de Pro, que está, en el producto final deseado, en la posición 16; (b) eliminar el grupo protector de N del producto obtenido de este modo; (c) acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado protegido apropiadamente en N de DPro, que está, en el producto final deseado, en la posición 15; (d) eliminar el grupo protector de N del producto obtenido en la etapa (c); (e) efectuar las etapas que corresponden sustancialmente a las etapas (c) y (d) utilizando derivados protegidos apropiadamente en N de los aminoácidos que, en el producto final deseado, se encuentran en las posiciones 14 a 1, estando igualmente protegidos cualquier grupo o grupos funcionales que puedan estar presentes en dichos derivados de aminoácidos protegidos apropiadamente en N; (f) si se desea, formar un enlace disulfuro entre las cadenas laterales de los residuos de Cys de la posición 4 y la posición 11; o alternativamente, formar el enlace mencionado anteriormente después de la etapa (i), tal como se describe en el presente documento a continuación; (g) separar el producto obtenido de este modo del soporte sólido; (h) ciclar el producto escindido del soporte sólido; (i) eliminar cualquier grupo protector presente en los grupos funcionales de los miembros de la cadena de residuos de aminoácido; y (j) si se desea, fijar uno o varios grupos isopropilo (k) si es necesario, eliminar cualquier grupo protector presente en los grupos funcionales de los miembros de la cadena de ácido amino y (l) si se desea, convertir el producto obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable o convertir una sal farmacéuticamente aceptable o inaceptable obtenida de este modo en el compuesto libre correspondiente, o en una sal farmacéuticamente aceptable diferente.

Los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención pueden ser producidos, por ejemplo, siguiendo un procedimiento que comprende la síntesis del péptido lineal sobre resina, mientras que el residuo o residuos de aminoácidos que tienen el grupo isopropilo Orn(iPr) o Lys(iPr) se incorporarán como unidad o unidades estructurales de aminoácidos que están disponibles comercialmente o se sintetizan previamente; o un procedimiento que comprende la síntesis de un péptido lineal sobre resina mediante la aplicación de una estrategia de grupos protectores ortogonales, en la que, por ejemplo, todas las cadenas laterales que tienen grupos amino de residuos de aminoácidos que no se pretenden modificar estarán protegidas por ivDde o similar, de modo que las cadenas laterales que tienen grupos amino de residuos de aminoácidos protegidos por grupos protectores lábiles a ácidos, adecuados para la estrategia de síntesis de péptidos en fase sólida basada en Fmoc, se pueden derivatizar mediante el acoplamiento de grupos isopropilo en solución en una etapa muy tardía de la cascada de síntesis; o siguiendo un procedimiento que comprende una combinación adecuada de los procedimientos descritos anteriormente.

La elección adecuada del soporte sólido funcionalizado (es decir, el soporte sólido más la molécula conectora) y el sitio de ciclación desempeñan un papel clave en el procedimiento de síntesis de los peptidomiméticos de horquilla β de la invención.

El soporte sólido funcionalizado deriva convenientemente de poliestireno reticulado, preferentemente, con un 1-5% de divinilbenceno; poliestireno recubierto con espaciadores de polietilenglicol (Tentagel®); y resinas de poliacrilamida (D. Obrecht, J. M. Villalgordo, "Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small- Molecular-Weight Compound Libraries", Tetrahedron Organic Chemistry Series, Vol. 17, Pergamon, Elsevier Science, 1998).

El soporte sólido se funcionaliza mediante un conector, es decir, una molécula espaciadora bifuncional que contiene en un extremo un grupo de anclaje para la fijación al soporte sólido y, en el otro extremo, un grupo funcional escindible selectivamente, utilizado para las transformaciones químicas posteriores y procedimientos de escisión.

Para los propósitos de la presente invención se utilizan dos tipos de conectores: Los conectores de tipo 1 están diseñados para liberar el grupo amida en condiciones ácidas (H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3783-3790). Los conectores de este tipo forman amidas con el grupo carboxilo de los aminoácidos; entre los ejemplos de resinas funcionalizadas mediante este tipo de estructuras de enlace se incluyen resina de 4- [(((2,4-dimetoxi-fenil)Fmoc-aminometil)fenoxiacetamido)aminometil]PS, resina de 4-[(((2,4-dimetoxifenil)Fmoc- aminometil)fenoxi-acetamido)aminometil]-4-metil-benzhidrilamina-PS (resina de amida de Rink MBHA PS), y resina de 4-[(((2,4-dimetoxi-fenil)Fmoc-aminometil)fenoxiacetamido)aminometil] benzhidrilamina-PS (resina de amida de Rink-BHA-PS). Preferentemente, el soporte deriva de poliestireno reticulado, de la forma más preferente, con 1-5% de divinilbenceno y funcionalizado mediante el conector 4-(((2,4-dimetoxifenil) Fmoc-aminometil)fenoxiacetamido).

Los conectores de tipo 2 están diseñados para liberar finalmente el grupo carboxilo en condiciones ácidas. Los conectores de este tipo forman ésteres lábiles en medio ácido con el grupo carboxilo de los aminoácidos, por lo general ésteres de bencilo, benzhidrilo y tritilo lábiles a ácido; entre los ejemplos de estas estructuras conectoras se incluyen 2-metoxi-4-hidroximetilfenoxi (conector Sasrin®), 4-(2,4-dimetoxifenil-hidroximetil)fenoxi (conector de Rink), ácido 4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi)butírico (conector HMPB), tritilo y 2-clorotritilo. Preferentemente, el soporte deriva de poliestireno reticulado, de la forma más preferente, con un 1-5% de divinil-benceno y funcionalizado mediante el conector 2-clorotritilo.

Cuando se llevan a cabo como síntesis en matriz paralela, los procedimientos de la presente invención pueden llevarse a cabo ventajosamente tal como se describe en el presente documento a continuación, pero se hará evidente de forma inmediata a los técnicos en la materia cómo estos procedimientos tendrán que ser modificados en caso de que se desee sintetizar un único compuesto de la invención.

Un número de recipientes de reacción igual al número total de compuestos que se van a sintetizar mediante el método paralelo, se cargan con 25 a 1.000 mg, preferentemente 60 mg, del soporte sólido funcionalizado apropiado, preferentemente poliestireno reticulado del 1 al 3% o resina Tentagel.

El disolvente que se va a utilizar debe ser capaz de hinchar la resina y entre los ejemplos del mismo se incluyen, sin que constituyan limitación, diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF), N-metil-pirrolidona (NMP), dioxano, tolueno, tetrahidrofurano (THF), etanol (EtOH), trifluoroetanol (TFE), alcohol isopropílico y similares. Las mezclas de disolventes que contienen, como mínimo, un componente de disolvente polar (por ejemplo, 20% TFE/DCM, 35% THF/NMP) son beneficiosas para asegurar una elevada reactividad y solvatación de las cadenas de péptidos unidas a la resina (G. B. Fields, C. G., Fields, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4202-4207).

Con el desarrollo de diversos conectores que liberan el grupo ácido carboxílico del extremo C-terminal en condiciones ácidas suaves, que no afectan a los grupos lábiles en medio ácido que protegen los grupos funcionales en la cadena o cadenas laterales, se han realizado importantes progresos en la síntesis de fragmentos peptídicos protegidos. El conector derivado de 2-metoxi-4-hidroxibencilalcohol (conector Sasrin®, Mergler y otros, Tetrahedron Lett. 1988, 29, 4005-4008) es escindible con ácido trifluoroacético diluido (0,5-1% de TFA en DCM) y es estable en las condiciones de desprotección de Fmoc durante la síntesis de péptidos, siendo compatibles con este esquema de protección los grupos protectores adicionales basados en Boc/tBu. Otros conectores que son adecuados para el procedimiento de la presente invención incluyen el conector lábil a super ácidos 4-(2,4-dimetoxifenil- hidroximetil)fenoxi (conector de Rink, H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3787-3790), en el que la eliminación del péptido requiere ácido acético al 10% en DCM o ácido trifluoroacético al 0,2% en DCM; el conector derivado del ácido 4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi)butírico (conector HMPB, Flörsheimer y Riniker, Peptides, 1991,1990 131) que también se escinde con TFA al 1%/DCM para dar un fragmento de péptido que contiene todos los grupos protectores de las cadenas laterales lábiles en medio ácido; y, además, el conector cloruro de 2-clorotritilo (Barlos y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946), que permite la escisión del péptido utilizando una mezcla de ácido acético glacial/trifluoroetanol/DCM (1:2:7) durante 30 min.

Los grupos protectores adecuados para los aminoácidos y, respectivamente, para sus residuos son, por ejemplo, - para el grupo amino (por ejemplo, tal como está presente además en la cadena lateral de lisina u ornitina) Cbz benciloxicarbonilo Boc terc-butiloxicarbonilo Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo Alloc aliloxicarbonilo Teoc trimetilsililetoxicarbonilo Tcc tricloroetoxicarbonilo Nps o-nitrofenilsulfonilo; Trt trifenilmetilo o tritilo ivDde (4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutilo - para el grupo carboxilo (por ejemplo, tal como está presente además en la cadena lateral del ácido glutámico) por conversión en ésteres con componentes alcohol tBu terc-butilo Bn bencilo Me metilo Ph fenilo Pac fenacil alilo Tse trimetilsililetilo Toe tricloroetilo; ivDde (4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutilo - para el grupo guanidino (tal como está presente, por ejemplo, en la cadena lateral de la arginina) Pmc 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo Ts tosilo (es decir, p-toluensulfonilo) Cbz benciloxicarbonilo Pbf pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo - para el grupo hidroxi (tal como está presente, por ejemplo, en la cadena lateral de la serina) tBu terc-butilo Bn bencilo Trt tritilo Alloc aliloxicarbonilo - y para el grupo mercapto (tal como está presente, por ejemplo, en la cadena lateral de la cisteína) Acm acetamidometilo tBu terc-butilo Bn bencilo Trt tritilo Mtr 4-metoxitritilo.

Los derivados de aminoácido protegidos con 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) se utilizan preferentemente como unidades estructurales para la construcción de los miméticos de bucle de horquilla β de la presente invención. Para la desprotección, es decir, la escisión del grupo Fmoc, se puede utilizar piperidina al 20% en DMF o DBU al 2%/piperidina al 2% en DMF.

Se conoce en la técnica el enlace de grupos isopropilo a las cadenas laterales que tienen un grupo amino de los derivados de aminoácidos protegidos con 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) para formar derivados de aminoácidos protegidos con 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) con cadenas laterales que tienen amina isopropilada. El procedimiento para la introducción de un grupo isopropilo se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante alquilación reductora, por ejemplo, el tratamiento del grupo amino de la cadena lateral que tiene un grupo amino de un componente de aminoácido tal como, por ejemplo, Orn con acetona en presencia de un agente reductor adecuado tal como, por ejemplo triacetoxiborohidruro de sodio. Los grupos protectores tales como, por ejemplo, Boc, adecuados para derivados de aminoácidos protegidos con 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) con cadenas laterales que tienen un grupo amina isopropilada se pueden introducir mediante una reacción posterior con dicarbonato de di- terc-butilo en presencia de una base, tal como bicarbonato sódico.

La cantidad de reactivo, es decir, del derivado de aminoácido, es normalmente de 1 a 20 equivalentes basados en los miliequivalentes por gramo (meq/g) de carga del soporte sólido funcionalizado (típicamente de 0,1 a 2,85 meq/g para resinas de poliestireno) pesados originalmente en el recipiente de reacción. Se pueden utilizar equivalentes adicionales de los reactivos, si es necesario, para conducir la reacción a su completitud en un tiempo razonable. Las estaciones de trabajo preferentes (que, sin embargo, no constituyen limitación) son la estación de Labsource Combi- chem, el Symphony de Protein Technologies y el sintetizador MultiSyn Tech's-Syro, el último equipado, además, con una unidad de transferencia y un contenedor de depósito durante el procedimiento de escisión del péptido lineal totalmente protegido del soporte sólido. Todos los sintetizadores son capaces de proporcionar un entorno controlado, por ejemplo, las reacciones pueden llevarse a cabo a temperaturas diferentes de la temperatura ambiente, así como en atmósferas de gas inerte, si se desea.

La formación de enlaces amida requiere la activación del grupo α-carboxilo para la etapa de acilación. Cuando esta activación se lleva a cabo por medio de las carbodiimidas de utilización común, tales como diciclohexilcarbodiimida (DCC, Sheehan y Hess, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 10671068) o diisopropilcarbodiimida (DIC, Sarantakis y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976, 73, 336-342), la diciclohexilurea resultante es insoluble y, respectivamente, la diisopropilurea es soluble en los disolventes utilizados generalmente. En una variación del procedimiento de carbodiimida, se incluye 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, König y Geiger, Chem. Ber 1970, 103, 788-798) como aditivo a la mezcla de acoplamiento. El HOBt impide la deshidratación, suprime la racemización de los aminoácidos activados y actúa como catalizador para mejorar las reacciones de acoplamiento lentas. Algunos reactivos de fosfonio han sido utilizados como reactivos de acoplamiento directo, tales como hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris- (dimetilamino)fosfonio (BOP) (Castro y otros, Tetrahedron Lett. 1975, 14, 1219-1222; Synthesis, 1976, 751-752), o hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (Py-BOP, Coste y otros, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 205-208), o terafluoroborato de [2-(1H-benzotriazol-1-il-)1,1,3,3-tetrametiluronio] de (TBTU), o hexafluorofosfato de [2-(1H-benzotriazol-1-il-)1,1,3,3-tetrametiluronio] (HBTU, Knorr y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930); estos reactivos de fosfonio también son adecuados para la formación in situ de ésteres de HOBt con los derivados de aminoácidos protegidos. Más recientemente se han utilizado también como reactivos de acoplamiento de difenoxifosforil azida (DPPA) o tetrafluoroborato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TATU) o hexafluorofosfato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU)/7-aza-1-hidroxibenzotriazol (HOAt, Carpino y otros, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281) o tetrafluoroborato de (6-cloro-1H-benzotriazol-1-il-)- N,N,N’,N’-1,1,3,3-tetrametil-uronio (TCTU), o hexafluorofosfato de [(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il-)-N,N,N’,N’-1,1,3,3- tetrametil-uronio] de (HCTU, Marder, Shivo y Albericio: HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications, Poster Presentation, Gordon Conference febrero 2002), así como hexafluorofosfato de 1,1,3,3-bis(tetrametilen)clorouronio (PyCIU, especialmente para el acoplamiento de aminoácidos N-metilados, J. Coste, E. Frérot, P. Jouin, B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 1967) o difenil-fosfinato de pentafluorofenilo (S. Chen, J. Xu, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6711).

Debido al hecho de que son esenciales reacciones de acoplamiento casi cuantitativas, es deseable tener una evidencia experimental de la compleción de las reacciones. El ensayo de ninhidrina (Kaiser y otros, Anal. Biochemistry 1970, 34, 595), en el que una respuesta colorimétrica positiva a una alícuota de péptido enlazado a resina indica cualitativamente la presencia de la amina primaria, se puede realizar de forma fácil y rápida después de cada etapa de acoplamiento. La química del Fmoc permite la detección espectrofotométrica del cromóforo de Fmoc cuando se libera con la base (Meienhofer y otros, Int. J. Peptide Protein Res. 1979, 13, 35-42).

Se lava el intermedio unido a la resina, dentro de cada recipiente de reacción, del exceso de reactivos retenidos, de disolventes y de subproductos mediante exposición repetitiva al disolvente o disolventes puros por uno de los dos procedimientos siguientes: 1) los recipientes de reacción se llenan con disolvente (preferentemente 5 ml), se agitan durante 5 a 300 minutos, preferentemente 15 minutos, y se drenan para expulsar el disolvente; 2) los recipientes de reacción se llenan con disolvente (preferentemente 5 ml) y se drenan a un recipiente receptor, tal como un recipiente o vial de ensayo.

Ambos procedimientos de lavado anteriores se repiten hasta aproximadamente 50 veces (preferentemente, aproximadamente 10 veces), siguiendo la eficiencia de la eliminación de reactivos, disolventes y subproductos mediante procedimientos tales como CCF, CG o inspección de las aguas de lavado.

El procedimiento descrito anteriormente de hacer reaccionar el compuesto unido a resina con reactivos dentro de los recipientes de reacción, seguido de la eliminación de los reactivos en exceso, los subproductos y los disolventes, se repite con cada transformación sucesiva hasta que se haya obtenido el péptido lineal completamente protegido final unido a la resina.

Antes de que este péptido lineal completamente protegido se separe del soporte sólido, se puede formar un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11.

Para la formación de un enlace disulfuro se aplica preferentemente una solución de 10 equivalentes de solución de yodo en DMF o en una mezcla de CH2Cl2/MeOH durante 1,5 h que se repite durante otras 3 h con una solución de yodo fresca después de la filtración de la solución de yodo, o en una mezcla de DMSO y solución de ácido acético, tamponada con NaHCO3 al 5% a pH 5-6 durante 4 h, o en agua después de ajustar a pH 8 con solución de hidróxido de amonio por agitación durante 24 h, o en una solución de NMP y tri-n-butilfosfina (preferentemente 50 eq).

Alternativamente, la formación del enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11 puede llevarse a cabo con posterioridad a al método de tratamiento 2), tal como se describe en el presente documento a continuación, mediante agitación del péptido crudo totalmente desprotegido y ciclado durante 24 h en agua que contiene DMSO hasta el 15% en volumen, tamponado con NaHCO3 al 5% a pH 5-6, o tamponado con acetato de amonio a pH 7-8, o ajustado con hidróxido de amonio a pH 8. Después de la evaporación a sequedad, se obtiene ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5- Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, como producto final.

La escisión del péptido lineal completamente protegido del soporte sólido se consigue mediante la exposición de la resina cargada con una solución del reactivo utilizado para la escisión (preferentemente 3 a 5 ml). El control de temperatura, la agitación, y el seguimiento de la reacción se implementan tal como se ha descrito anteriormente. A través de una unidad de transferencia, los recipientes de reacción están conectados con un contenedor de depósito que contiene recipientes de depósito para recoger eficientemente las soluciones de producto escindido. Las resinas que quedan en los recipientes de reacción se lavan posteriormente de 2 a 5 veces, tal como anteriormente, con de 3 a 5 ml de un disolvente apropiado para extraer (lavar) el máximo de productos separados como sea posible. De este modo, las soluciones de productos obtenidos se combinan, teniendo cuidado de evitar la mezcla cruzada. A continuación, las soluciones/extractos individuales se manipulan según sea necesario para aislar los compuestos finales. Entre las manipulaciones típicas se incluyen, sin que constituyan limitación, evaporación, concentración, extracción líquido/líquido, acidificación, basificación, neutralización o reacciones en solución adicionales.

Las soluciones que contienen derivados de péptidos lineales totalmente protegidos que han sido escindidos del soporte sólido y neutralizados con una base, se evaporan. La ciclación se lleva a cabo a continuación en solución utilizando disolventes tales como DCM, DMF, dioxano, THF y similares. Varios reactivos de acoplamiento que se han mencionado anteriormente se pueden utilizar para la ciclación. La duración de la ciclación es de aproximadamente 6-48 horas, preferentemente de aproximadamente 16 horas. El progreso de la reacción se sigue, por ejemplo por RP-HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa). A continuación, se elimina el disolvente por evaporación, el derivado de péptido cíclico completamente protegido se disuelve en un disolvente que no es miscible con agua, tal como DCM, y la solución se extrae con agua o una mezcla de disolventes miscibles con agua, a fin de eliminar cualquier exceso del reactivo de acoplamiento.

Finalmente, el derivado de péptido completamente protegido se trata con 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIS u otra combinación de secuestrantes para llevar a cabo la escisión de los grupos protectores. El tiempo de reacción de escisión es habitualmente de 30 minutos a 12 horas, preferentemente de aproximadamente 2,5 horas

Alternativamente, la separación y la desprotección completa del péptido completamente protegido del soporte sólido se puede lograr manualmente en recipientes de vidrio.

Después de la desprotección completa, por ejemplo, los siguientes métodos pueden utilizarse para su posterior procesamiento: 1) Los componentes volátiles se evaporan a sequedad y el péptido crudo se disuelve en AcOH al 20% en agua y se extrae con éter isopropílico u otros disolventes que son adecuados para ello. La fase acuosa se recoge y se evapora hasta sequedad, y se obtiene el péptido totalmente desprotegido, ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5- Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, como producto final; 2) La mezcla de desprotección se concentra al vacío. Después de la precipitación del péptido totalmente desprotegido en éter dietílico, preferentemente a 0°C, el sólido se lava hasta aproximadamente 10 vece s, preferentemente 3 veces, se seca, y se obtiene el péptido totalmente desprotegido, ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4- Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, como producto final, si un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11 se ha formado sobre un soporte sólido, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Si se ha seguido la estrategia mencionada de grupos protectores ortogonales para la introducción de uno o más grupos isopropilo en solución, entonces todos los grupos amino de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos están aún protegidos por grupos protectores no lábiles a ácido, mientras que los grupos amino de los residuos de aminoácidos protegidos anteriormente por grupos protectores lábiles a ácido se han liberado en esta etapa de la cascada de síntesis. De este modo, es posible, si se desea, acoplar un grupo isopropilo. Preferentemente, ivDde o similares son grupos protectores estables a ácido para cadenas laterales con grupos amino que se mantienen sin modificar durante el acoplamiento de grupos isopropilo a grupos amino liberados. Este acoplamiento se puede lograr, por ejemplo, mediante la aplicación de una alquilación reductora utilizando acetona en presencia de un agente reductor adecuado como, por ejemplo cianoborohidruro de sodio. De este modo, por ejemplo, el péptido se disuelve en MeOH (4,4 mM) que contiene ácido acético (0,2 M). Después de añadir un exceso de acetona (780 eq) la mezcla de reacción se completa con una solución de cianoborohidruro de sodio en MeOH (0,6 M; 1,3 eq por grupo isopropilo que se desea introducir) y se agita vigorosamente a temperatura ambiente. Tras la compleción de la conversión, monitorizada por LC-MS, se añade agua y se evaporan los disolventes. El sólido residual que contiene el péptido se disuelve en DMF (0,01 M) y se utiliza una solución de hidracina al 5% en DMF para finalmente eliminar los grupos protectores ivDde.

Tal como se ha mencionado anteriormente, es posible a partir de este momento, si se desea, convertir el producto cíclico totalmente desprotegido obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable, obtenida de este modo en el compuesto libre correspondiente o en una sal farmacéuticamente aceptable diferente. Cualquiera de estas operaciones puede llevarse a cabo por métodos bien conocidos en la técnica.

Los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones con el fin de prevenir las infecciones por VIH en individuos sanos y retrasar o detener la progresión viral en pacientes infectados, o cuando se da cáncer mediado por la actividad del receptor CXCR4 o que es el resultado de la misma, o cuando se dan enfermedades inmunitarias mediadas por la actividad del receptor CXCR4 o que son el resultado de la misma; o estos peptidomiméticos de horquilla β se pueden utilizar para tratar la inmunosupresión, o pueden ser utilizados durante recolecciones por aféresis de células madre de sangre periférica y/o como agentes para inducir la movilización de células madre para regular la reparación de tejidos.

Los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención pueden administrarse per se o se pueden aplicar como una formulación apropiada junto con portadores, diluyentes o excipientes bien conocidos en la técnica.

Cuando se utilizan para tratar o prevenir infecciones por VIH o cáncer, como cáncer de mama, el cáncer de cerebro, el cáncer de próstata, el carcinoma heptatocelular, el cáncer colorrectal, el cáncer de pulmón, el cáncer de riñón, neuroblastoma, el cáncer de ovario, el cáncer endometrial, el tumor de células germinales, el cáncer de ojo, el mieloma múltiple, el cáncer de páncreas, el cáncer gástrico, el rabdomiosarcoma, el melanoma, la leucemia limfofocítica crónica, la leucemia mielógena aguda, la leucemia linfoblástica aguda, el mieloma múltiple y el linfoma no Hodgkin; metástasis, angiogénesis y tejidos hematopoyéticos; o trastornos inflamatorios, tales como el asma, la rinitis alérgica, las enfermedades pulmonares por hipersensibilidad, la neumonitis por hipersensibilidad, las neumonías eosinofílicas, la hipersensibilidad de tipo retardado, la enfermedad pulmonar intersticial (ILD), fibrosis pulmonar idiopática, la ILD asociada con artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico, la espondilitis anquilosante, la esclerosis sistémica, el síndrome de Sjogren, la anafilaxis o respuestas de hipersensibilidad sistémicas, las alergias a medicamentos, la artritis reumatoide, la artritis psoriásica, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la aterosclerosis, la miastenia grave, la diabetes de inicio juvenil, la glomerulonefritis, la tiroiditis autoinmune, el rechazo de injerto, incluyendo el rechazo de aloinjertos o la enfermedad de injerto contra huésped, las enfermedades inflamatorias del intestino y la dermatosis inflamatoria; o para tratar enfermedades oculares, tales como glaucoma, retinopatía diabética y degeneración macular asociada con la edad; o para tratar el accidente cerebrovascular isquémico focal, la isquemia cerebral global, el infarto de miocardio, la isquemia de las extremidades posteriores o isquemia periférica; o para tratar lesiones del hígado, riñón o pulmón; o para tratar la inmunosupresión, incluyendo la inducida por quimioterapia, radioterapia o el rechazo de injerto/trasplante, los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención pueden administrarse solos, como mezclas de varios peptidomiméticos de horquilla β, en combinación con otros agentes anti-VIH, o agentes antimicrobianos o agentes anticancerígenos o agentes antiinflamatorios, o en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos. Los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención pueden administrarse per se o como composiciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención se pueden fabricar por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de comprimidos recubiertos, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o adyuvantes fisiológicamente aceptables, que facilitan el procesamiento de los peptidomiméticos de horquilla β activos en preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende del método de administración elegido.

Para la administración tópica, los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención pueden formularse como soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, polvos, etc., que son bien conocidos en la técnica.

Las formulaciones sistémicas incluyen las diseñadas para la administración mediante inyección, por ejemplo inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o intratecal, así como las diseñadas para administración transdérmica, transmucosa, oral o pulmonar.

Para las inyecciones, los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención se pueden formular en soluciones adecuadas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hink, solución de Ringer, o tampón fisiológico salino. Las soluciones pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención pueden estar en forma de polvo para la combinación con un portador adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su utilización. Para la administración transmucosa, se utilizan penetrantes apropiados para la barrera a permear en la formulación, tal como se conoce en la técnica.

Para la administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando los peptidomiméticos de horquilla β activos de la presente invención con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Estos portadores permiten que los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, polvos, etc., para la ingestión oral por un paciente que se va a tratar. Para formulaciones orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, entre los excipientes adecuados se incluyen cargas, tales como azúcares, tales como lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación; y agentes aglutinantes. Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidonas reticuladas, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación sólidas pueden estar recubiertas de azúcar o con recubrimiento entérico utilizando técnicas estándar.

Para las preparaciones líquidas orales, tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, entre los portadores, excipientes o diluyentes adecuados se incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Además, se pueden añadir agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares.

Para la administración yugal, la composición puede tomar la forma de comprimidos, pastillas, etc. formulados de la forma habitual.

Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios, junto con bases de supositorio adecuadas, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención también se pueden formular como preparaciones de liberación lenta. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Para la fabricación de tales preparaciones de liberación lenta, los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como sales poco solubles.

Además, se pueden utilizar otros sistemas de administración farmacéutica, tales como liposomas y emulsiones bien conocidos en la técnica. Ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido, también pueden utilizarse. Adicionalmente, los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención se pueden administrar utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico (por ejemplo, para stents recubiertos). Han sido establecidos diversos materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los técnicos en la materia. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del agente terapéutico, se pueden utilizar estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.

Dado que los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención contienen residuos cargados, se pueden incluir en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como tales o como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las formas libres correspondientes. Entre las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas se incluyen sales con ácidos carboxílicos, fosfónicos, sulfónicos y sulfámicos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tales como ácido glutámico o ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4- aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido metanosulfónico o ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 2- naftalenosulfónico, ácido 1,5-naftalenodisulfónico, ácido 2, 3 o 4-metil-bencenosulfónico, ácido 3-metil- bencenosulfónico o ácido 4-metil-bencenosulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclohexilsulfámico, ácido N-metil-sulfámico, ácido N-etil-sulfámico o ácido N-propil-sulfámico, y otros ácidos protónicos orgánicos, tales como ácido ascórbico. Los ácidos inorgánicos adecuados son, por ejemplo, hidrácidos halogenados, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico.

Los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención, o composiciones de los mismos, se utilizarán generalmente en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Debe entenderse que la cantidad utilizada dependerá de la aplicación particular.

Para la administración tópica para tratar o prevenir infecciones por VIH una dosis terapéuticamente eficaz se puede determinar utilizando, por ejemplo, los ensayos in vitro proporcionados en los ejemplos. El tratamiento se puede aplicar cuando la infección por VIH es visible, o incluso cuando no es visible. El experto en la materia será capaz de determinar cantidades terapéuticamente eficaces para tratar infecciones de VIH tópicas sin experimentación indebida.

Para la administración sistémica, una dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante de peptidomimético de horquilla β que incluye la IC50 tal como se ha determinado en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

Las dosis iniciales también se pueden determinar a partir de datos in vivo, por ejemplo, de modelos animales, utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a humanos en base a los datos en animales.

Las dosis para su aplicación como agentes anti-VIH se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma de los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención suficientes para mantener el efecto terapéutico. Los niveles séricos terapéuticamente eficaces se pueden lograr mediante la administración de múltiples dosis cada día.

En caso de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva de los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención puede no estar relacionada con la concentración plasmática. El experto en la materia será capaz de optimizar las dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin excesiva experimentación.

La cantidad administrada de peptidomiméticos de horquilla β dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, de la gravedad de la afección, de la forma de administración y del juicio del médico prescriptor.

La terapia anti-VIH se puede repetir intermitentemente mientras las infecciones son detectables o incluso cuando no son detectables. La terapia se puede proporcionar sola o en combinación con otros fármacos, tales como, por ejemplo, otros agentes anti-VIH o agentes anticancerígenos, u otros agentes antimicrobianos.

Normalmente, una dosis terapéuticamente eficaz de los peptidomiméticos de horquilla β descritos en el presente documento proporcionará un beneficio terapéutico sin causar una toxicidad sustancial.

La toxicidad de los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, mediante la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100 % de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico. Son preferentes los compuestos que exhiben índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosificación que no es tóxico para su utilización en seres humanos. La dosificación de los peptidomiméticos de horquilla β de la presente invención se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis efectiva con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro del intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación, la vía de administración y dosis exactas pueden ser elegidas por el médico individual en vista del estado del paciente (véase, por ejemplo, Fingl y otros 1975, En: “The Pharmacological Basis of Therapeutics” (Las bases farmacológicas de la terapéutica), cap. 1, pág. 1).

La presente invención también puede incluir compuestos, que son idénticos a los compuestos de fórmula general ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), con un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, excepto porque uno o más átomos están reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o un número másico diferente de la masa atómica o el número másico encontrados normalmente en la naturaleza, por ejemplo, compuestos enriquecidos en 2H (D),3H,11C,14C,129I, etc. Estos análogos isotópicos y sus sales y formulaciones farmacéuticas se consideran agentes útiles en la terapia y/o el diagnóstico, por ejemplo, sin que constituya limitación, en los que un ajuste fino del tiempo de vida media in vivo podría conducir a un régimen de dosificación optimizado.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención, pero no deben interpretarse en ningún modo como limitantes de su alcance.

Ejemplos

1. Síntesis de péptidos

Acoplamiento del primer residuo de aminoácido protegido a la resina

Se cargó 1 g (1,4 mmol) de resina de 2-clorotritilo (1,4 mmol/g; 100-200 mesh, matriz de copoli(estireno-1% DVB); Barlos y otros Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946) en un matraz seco. La resina se suspendió en CH2Cl2 (5 ml) y se dejó hinchar a temperatura ambiente con agitación constante durante 30 minutos. Se añadió una solución de 0,98 mmol (0,7 eq) del primer residuo de aminoácido adecuadamente protegido (véase a continuación) en CH2Cl2 (5 ml) mezclado con 960 µI (4 eq) de diisopropiletilamina (DIEA). Después de agitar la mezcla de reacción a 25oC durante 4 h, la resina se filtró y se lavó de forma sucesiva con CH2Cl2 (1x), DMF (1x) y CH2Cl2 (1x). Una solución de CH2Cl2/MeOH/DIEA (17/2/1, 10 ml) se añadió a la resina y la suspensión se agitó durante 30 min. Después de la filtración se lavó la resina en el siguiente orden con CH2Cl2 (1x), DMF (1x), CH2Cl2 (1x), MeOH (1x), CH2Cl2 (1x), MeOH (1x), CHO (2x), Et2O (2x) y se secó con vacío durante 6 horas.

La carga fue típicamente de 0,6 a 0,7 mmol/g.

Se prepararon las siguientes resinas precargadas: Resina Fmoc-Pro-2-clorotritilo.

La síntesis se llevó a cabo empleando un sintetizador Syro-peptide (MultiSynTech) utilizando 24-96 recipientes de reacción. En cada recipiente se colocaron 0,04 mmol de la resina anterior y la resina se hinchó en CH2Cl2 y DMF durante 15 min, respectivamente. Se programaron los siguientes ciclos de reacción y se llevaron a cabo:

Etapa Reactivo

Tiempo

1 DMF, lavado 2 x 1 min 2 20% piperidina/DMF 1 x 5 min, 1x15 min 3 DMF, lavado 5 x 1 min.

4 5 eq aminoácido Fmoc /DMF 1 x 60 min.

+ 5 eq Py-BOP/DMF, 10 eq DIEA/DMF 6 DMF, lavado 3 x 1 min.

La etapa 4 se repitió una vez.

A menos que se indique lo contrario, el acoplamiento final de un aminoácido fue seguido por la desprotección del grupo Fmoc mediante la aplicación de las etapas 1-3 del ciclo de reacción descrito anteriormente.

Síntesis de las unidades estructurales de aminoácidos

Síntesis de Fmoc-Orn(iPr, Boc)-OH

La síntesis del ácido (2S)-Nα-fluorenilmetoxicarbonil-Nω,Nω-terc-butiloxicarbonil-isopropil-2,5-diaminopentanoico se llevó a cabo mediante la suspensión de 15,2 g de Fmoc-Orn-OH*HCl en 150 ml de THF (0,26 M) seguido de la adición de 375 ml de acetona (132 eq) y 20,6 g de triacetoxiborohidruro de sodio (2,5 eq). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h y, después de la compleción de la reacción (monitorizada por LC-MS) se añadieron 120 ml de solución saturada de Na2CO3 y 10,2 g de Boc2O (1,2 eq). Después de agitar durante toda la noche, se añadieron de nuevo solución saturada de Na2CO3 y Boc2O dos veces en porciones de acuerdo con el material de partida restante.

Tras la compleción de la introducción de Boc se añadió hexano dos veces, se separó, y la capa acuosa se acidificó con HClac. 5 N (pH = 1) y se extrajo a continuación tres veces con acetato de etilo. Por último, las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4 y se evaporaron para obtener el producto como espuma blanca. La unidad estructural de aminoácido Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH se puede sintetizar de forma análoga o se encuentra disponible comercialmente.

Las unidades estructurales de aminoácidos Fmoc-Tyr(Me)-OH y Fmoc-DTyr(Me)-OH se encuentran también disponibles comercialmente.

Ciclación y procesamiento de los péptidos de cadena principal ciclada

Escisión del fragmento de péptido totalmente protegido

Después de la compleción de la síntesis, la resina (0,04 mmol) se suspendió en 1 ml (0,13 mmol, 3,4 eq) de TFA al 1% en CH2Cl2 (v/v) durante 3 minutos, se filtró, y el filtrado se neutralizó con 1 ml (0,58 mmol, 14,6 eq) de DIEA al 10% en CH2Cl2 (v/v). Este procedimiento se repitió tres veces para asegurar la compleción de la escisión. El filtrado se evaporó a sequedad y una muestra del producto se desprotegió totalmente mediante la utilización de una mezcla de escisión que contenía el 95% de ácido trifluoroacético (TFA), el 2,5% de agua y el 2,5% de triisopropilsilano (TIS) para analizarse por HPLC de fase inversa (columna C18) y ESI-MS para controlar el rendimiento de la síntesis del péptido lineal.

Ciclación del péptido lineal

El péptido lineal completamente protegido (0,04 mmol) se disolvió en DMF (4 µmol/ml). Posteriormente se añadieron 30,4 mg (0,08 mmol, 2 eq) de HATU, 10,9 mg (0,08 mmol, 2 eq) de HOAt y 28 µl (0,16 mmol, 4 eq) de DIEA, y la mezcla se agitó en vórtex a 25°C durante 16 horas y posteriormente se concentró a alto vacío. El residuo se repartió entre CH2Cl2 y H2O/CH3CN (90/10: v/v). La fase de CH2Cl2 se evaporó para obtener el péptido cíclico completamente protegido.

Desprotección completa del péptido cíclico

El péptido cíclico obtenido se disolvió en 3 ml de la mezcla de escisión que contenía el 82,5% de ácido trifluoroacético (TFA), el 5% de agua, el 5% de tioanisol, el 5% de fenol y el 2,5% de etanoditiol (EDT). La mezcla se dejó en reposo a 25°C durante 2,5 horas y después s e concentró a vacío. Después de la precipitación del péptido cíclico totalmente desprotegido en éter dietílico (Et2O) a 0°C, el sólido se lavó dos veces con Et 2O y se secó.

Formación del enlace disulfuro de cadena β y purificación

Después de la desprotección completa, el péptido crudo se disolvió en tampón de acetato de amonio 0,1 M (1 mg/1 ml, pH = 7-8). Se añadió DMSO (hasta el 5% en volumen) y la solución se agitó durante toda la noche. Después de la evaporación, el residuo se purificó por HPLC preparativa de fase reversa.

Después de la liofilización, los productos se obtuvieron como polvos blancos y se analizaron mediante el siguiente método analítico: Los tiempos de retención en HPLC analítica (RT, en minutos) se determinaron utilizando una columna C18 Ascentis Express, 50 x 3,0 mm, (cod. 53811-U-Supelco) con los siguientes disolventes A (H2O + TFA al 0,1%) y B (CH3CN + TFA al 0,1%) y el gradiente: 0 a 0,05 min: 97% de A, 3% de B; 3,4 min: 33% de A 67% de B; 3,41-3,65 min: 3% de A, 97% de B; 3,66 a 3,7 min: 97% de A, 3% de B. Caudal = 1,3 ml/min; UV-Vis = 220 nm.

Ejemplo 1

La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. A esta resina, se injertó DPro, en la posición final 15. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15-Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12- Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DPro7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr3-His2-Tyr1. Después de una desprotección final de Fmoc, tal como se ha descrito anteriormente, el péptido se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace disulfuro de cadena β, tal como se ha descrito anteriormente, se purificó tal como se ha indicado anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico tal como se ha descrito anteriormente (pureza de UV [después de HPLC preparativa]: 95%; RT: 1,56; [M + 3H] / 3 = 685,7).

Ejemplo 2: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. A esta resina, se injertó DPro, en la posición final 15. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15- Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DPro7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr(Me)3-His2-Tyr1.

Después de una desprotección final de Fmoc, tal como se ha descrito anteriormente, el péptido se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace disulfuro de cadena β, tal como se ha descrito anteriormente, se purificó tal como se ha indicado anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico tal como se ha descrito anteriormente (pureza de UV [después de HPLC preparativa]: 95%; RT: 1,7; [M + 3H] / 3 = 690,4).

Ejemplo 3: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. A esta resina, se injertó DPro, en la posición final 15. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15- Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Dab8-DTyr7-Ala6-Ser5-Cys4-Ala3-His2-Tyr1. Después de una desprotección final de Fmoc, tal como se ha descrito anteriormente, el péptido se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace disulfuro de cadena β, tal como se ha descrito anteriormente, se purificó tal como se ha indicado anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico tal como se ha descrito anteriormente (pureza de UV [después de HPLC preparativa]: 95%; RT: 1,57; [M + 3H] / 3 = 658,3).

Ejemplo 4: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. A esta resina, se injertó DPro, en la posición final 15. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15- Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DTyr(Me)7-Ala6-Ser5-Cys4-Ala3-His2-Tyr1.

Después de una desprotección final de Fmoc, tal como se ha descrito anteriormente, el péptido se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace disulfuro de cadena β, tal como se ha descrito anteriormente, se purificó tal como se ha indicado anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico tal como se ha descrito anteriormente (pureza de UV [después de HPLC preparativa]: 95%; RT: 1,70; [M + 3H] / 3 = 681,7).

Ejemplo 5: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. A esta resina, se injertó DPro, en la posición final 15. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resin-Pro16-DPro15- Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys1-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DTyr7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr3-His2-Tyr1. Después de una desprotección final de Fmoc, tal como se ha descrito anteriormente, el péptido se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace disulfuro de cadena β, tal como se ha descrito anteriormente, se purificó tal como se ha indicado anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico tal como se ha descrito anteriormente (pureza de UV [después de HPLC preparativa]: 95%; RT: 1,60; [M + 3H] / 3 = 707,4).

Ejemplo 6: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. A esta resina, se injertó DPro, en la posición final 15. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15- Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DTyr(Me)7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr(Me)3-His2-Tyr1.

Después de una desprotección final de Fmoc tal como se ha descrito anteriormente, el péptido se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace disulfuro de cadena β, tal como se ha descrito anteriormente, se purificó tal como se ha indicado anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico tal como se ha descrito anteriormente (pureza de UV [después de HPLC preparativa]: 95%; RT: 1,83; [M + 3H] / 3 = 717,0).

2. Métodos biológicos

2.1. Preparación de los péptidos

Los péptidos liofilizados se pesaron en una microbalanza (Mettler MT5) y se disolvieron en DMSO a una concentración final de 10 mM. Las soluciones madre se mantuvieron a +4°C, protegidas de la luz. Los en sayos biológicos se llevaron a cabo en condiciones de ensayo que tienen menos del 1% de DMSO, a menos que se indique lo contrario.

2.2. Cultivo de células

Se cultivaron células Namalwa (células no adherentes que expresan CXCR4 de forma nativa, ATCC CRL-1432) en RPMI 1640 más el 10% de SFB, y pen/strept. Se mantuvieron células HELA en RPMI 1640 más un 10% de FBS, pen/strept y L-glutamina 2 mM. Se cultivaron células Cos-7 en medio DMEM con 4.500 mg/ml de glucosa suplementado con 10% de FCS, pen/strept y L-glutamina 2 mM. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37°C con el 5% de CO2. Los medios celulares, los suplementos de medios, el tampón de PBS, el HEPES, el antibiótico/antimicótico, la pen/strept, el aminoácido no esencial, la L-glutamina, el β-mercaptoetanol y el suero se adquirieron de Gibco (Pailsey, Reino Unido). Todos los productos de química fina fueron suministrados por Merck (Darmstadt, Alemania).

2.3. Ensayo quimiotáctico (ensayo de migración celular)

La respuesta quimiotáctica de las células Namalwa (ATCC CRL-1432) a un gradiente de factor 1α estromal derivado de células (SDF-1) se midió utilizando un sistema de cámara de quimiotaxis de Boyden modificada (ChemoTX; Neuroprobe). En este sistema, la cámara superior de cada pocillo está separada de la cámara inferior, que contiene el SDF-1 quimioatrayente por una membrana de policarbonato (tamaño de poro de 5 µm). Un área circular de esta membrana en la región que cubre cada pocillo inferior está rodeada por una máscara hidrófoba para retener la suspensión de células dentro de este área. El sistema se preparó mediante la carga de los pocillos de fondo con alícuotas de 30 de medio de quimiotaxis (RPMI 1640 sin rojo fenol + 0,5% de BSA) que comprendían las diluciones en serie apropiadas de péptidos o ningún péptido en combinación con SDF-1 (0,9 nM), o sin el quimioatrayente. La membrana se colocó sobre los pocillos de fondo, y se administraron alícuotas de 50 µl de una suspensión de células Namalwa (3,6 x 106 células/ml) en medio de quimiotaxis, premezcladas con medio de quimiotaxis que comprendían o diluciones en serie apropiadas de péptidos o ningún péptido sobre cada una de las regiones limitadas hidrofóbicamente de la superficie superior de la membrana. Las células se dejaron migrar hacia la cámara inferior durante 5 horas a 37ºC en el 5% de CO2. Después de este período, la membrana se eliminó y su cara superior se limpió cuidadosamente y se lavó con PBS para eliminar las células no migradas. Las células migradas se transfirieron mediante un adaptador de "embudo" a una placa de recepción de 96 pocillos y el número de células se determinó utilizando el ensayo de proliferación de células CyQuant NF® (Invitrogen), basado en la medición del contenido de ADN celular mediante unión a colorante fluorescente. Siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadieron 50 µl de reactivo colorante de CyQuant®/tampón de HBSS (1/500 [v/v]) a cada pocillo de la placa de recepción de 96 pocillos mencionada anteriormente. Después de la incubación durante 0,5 h a temperatura ambiente, la placa se selló y la intensidad de fluorescencia de cada muestra se midió utilizando un lector de placas Wallac 1420 VICTOR2® (PerkinElmer) con excitación a 485 nm y detección de emisión a 535 nm. Por último, los datos se normalizaron mediante la utilización de los controles y los valores de IC50 se determinaron utilizando GraphPad Prism® (GraphPad) ajustando una curva logarítmica a los puntos de datos promediados.

2.4. Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de los péptidos a células HELA (Acc57) y células COS-7 (CRL-1651) se determinó utilizando el ensayo de reducción de MTT (T. Mossman, J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63; M.V. Berridge, A.S. Tan, Arch.

Biochem. Biophys.1993, 303, 474-482). Brevemente, el procedimiento es tal como sigue; Se sembraron 4.000 células HELA y 3.400 células COS-7 por pocillo y se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos durante 24 h a 37ºC al 5% de CO2. A continuación el tiempo cero (tz) se determinó por reducción de MTT (véase a continuación). El sobrenadante de los pocillos restantes se descartó y se pipeteó en los pocillos medio fresco y compuestos en diluciones en serie (12,5, 25 y 50 µΜ triplicados, 0 µm, blanco). Después de la incubación de las células durante 48 horas a 37°C al 5% de CO 2, el sobrenadante se descartó de nuevo y se añadieron a cada pocillo 100 µl de reactivo MTT (0,5 mg/ml en RPMI1640). Después de la incubación a 37ºC durante 2-4 horas, se aspiraron los medios y se inocularon las células (100 µl de isopropanol/pocillo). Se midió la absorbancia a 595 nm del formazano solubilizado (OD595péptido). Para cada concentración se calcularon promedios de los triplicados. El porcentaje de crecimiento se calculó como sigue: (OD595péptido - OD595tz) / (OD595blanco - OD595tz) x 100%. Las concentraciones IC50 (Inhibición de Crecimiento) se calcularon para cada péptido utilizando una función de línea de tendencia para las concentraciones (50, 25, 12,5 y 0 µΜ), los correspondientes porcentajes y el valor 50 (=TREND (C50:C0, %50, %0; 50).

2.5. Hemólisis

Los péptidos se ensayaron para determinar su actividad hemolítica contra glóbulos rojos humanos (hRBC). Se lavaron hRBC frescos cuatro veces con tampón fosfato salino (PBS) y se centrifugaron durante 10 min a 3.000 x g. Los compuestos (100 µM) se incubaron con 20% hRBC (v/v) durante 1 hora a 37°C y agitación a 300 rpm. La concentración de eritrocitos final fue aproximadamente 0,9 x 109 células/ml. Un valor de 0% y 100% de lisis celular, respectivamente, se determinó por incubación de hRBC en presencia de PBS que contenía el 0,001% de ácido acético y el 2,5% de Triton X-100 en H2O, respectivamente. Las muestras se centrifugaron, los sobrenadantes se diluyeron 8 veces en tampón PBS y las densidades ópticas (OD) se midieron a 540 nm. El valor de 100% de lisis (OD540H2O) dio una OD540 de aproximadamente 0,5 a 1,0. El porcentaje de hemólisis se calculó como sigue: (OD540péptido / OD540H2O) x 100%.

2.6. Estabilidad plasmática

La estabilidad de los péptidos en plasma humano y de ratón se determinó aplicando el método siguiente: se enriquecieron 346,5 µl/pocillo profundo de plasma humano recién descongelado (Basler Blutspende-dienst) y plasma de ratón (Harlan Sera-Lab, Reino Unido), respectivamente, con 3,5 µl/pocillo de compuesto disuelto en DMSO/H2O (90/10 [v/v], 1 mM, por triplicado) y se incubaron a 37°C. Se transfirieron en t = 0, 15, 30, 60, 120, 240 y 1.440 min alícuotas de 50 µl a pocillos de placa de filtración que contenían 150 µl/pocillo de ácido fórmico al 2% en acetonitrilo. Después de agitar durante 2 minutos, las suspensiones que se generaron se filtraron al vacío. Se transfirieron 100 µl de cada filtrado a una placa de microtitulación de propileno y se secaron bajo N2. Los sólidos residuales se reconstituyeron mediante la adición de 100 µl/pocillo de agua/acetonitrilo, 95/5 (v/v) + 0,2% de ácido fórmico y se analizaron por LC/MS tal como sigue: Columna: Waters, XBridge C18, fases móviles: (A) agua + 0,1% de ácido fórmico y (B) acetonitrilo/agua, 95/5 (v/v) + 0,1% de ácido fórmico, gradiente: 5%-100% (B) en 1,8 minutos, ionización por electrospray, detección MRM (triple cuadrupolo). Las áreas de los picos se determinaron por triplicado y los valores se promediaron. La estabilidad se expresa en porcentaje del valor inicial en t = 0. (tx / t0 x 100). Mediante la utilización de la función TREND de Excel (Microsoft Office 2003) se determinaron T1/2.

2.7. Unión a proteínas plasmáticas

Se colocaron 495 µl de alícuotas de plasma humano (Basler Blutspendedienst), así como 495 µl de alícuotas de PBS en pocillos profundos individuales de una placa de polipropileno (Greiner) y se inocularon en cada uno 5 µl de soluciones 1 mM de péptidos en 90% de DMSO. Después de agitar la placa durante 2 min a 600 rpm se transfirieron alícuotas de 150 µl de las mezclas de plasma/péptidos por triplicado a la placa de filtración de polipropileno (10 kDa, Millipore), a la vez que se transfirieron alícuotas de 150 µl de las mezclas PBS/péptido bien a los pocillos individuales de la placa de filtración (controles filtrados) o bien directamente en los pocillos individuales de la placa receptora (Greiner) (controles sin filtrar). La placa sándwich, que comprendía la placa de filtración y la placa de recepción se incubó durante 1 h a 37°C y a continuación se centrifugó a 3.220 g durante 2 horas a 15°C. Los filtrados en la placa receptora se analizaron mediante LC/MS tal como sigue: Columna: Waters, XBridge C18, fases móviles: (A) agua + 0,1% de ácido fórmico y (B) acetonitrilo/agua, 95/5 (v/v) + 0,1% de ácido fórmico, gradiente: 5%-100% (B) en 1,8 min, ionización por electrospray, detección MRM (triple cuadrupolo). Las áreas de los picos se determinaron por triplicado y los valores se promedian. La unión se expresa en porcentaje de los controles filtrados y no filtrados por 100-(100 x T1h / Tctr). Finalmente se calcula el promedio de estos valores.

Los resultados de los experimentos descritos en los puntos 2.3 – 2.7 se indican en las tablas 1, 2, 3 y 4 en el presente documento a continuación.

2.8. Estudio farmacocinético (PK)

Se realizaron estudios farmacocinéticos para los compuestos de los ejemplos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 después de que se realizara una administración intravenosa (iv).

Se utilizaron ratones varones CD-1 de 30 gramos (± 20%) obtenidos de Charles River Laboratories Deutschland GmbH. El portador, tampón fosfato salino, se añadió para dar una concentración final de 0,5 mg/ml del compuesto. El volumen fue de 2 ml/kg y el compuesto se inyectó para dar una dosis intravenosa final de 1 mg/kg. Se extrajeron aproximadamente 300-400 µl de sangre bajo anestesia suave de isoflurano por punción cardiaca a intervalos predeterminados de tiempo (5, 15, 30 min y 1, 2, 3, 4, horas) y se añadieron a recipientes heparinizados. El plasma se eliminó de las células sedimentadas tras la centrifugación y se congeló a -80°C antes del análisis por HPLC-MS.

Preparación de muestras de calibración de plasma y muestras de estudio de plasma

Las alícuotas de 50 µl cada una de plasma de ratón de animales no tratados (plasma de ratón "blanco") se enriquecieron con cantidades conocidas de los compuestos ejemplos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 a fin de obtener 10 muestras de plasma de calibración para cada compuesto en el intervalo de 1 a 4.000 ng/ml. Se utilizaron alícuotas de 50 µl cada una de plasma de ratón de los animales tratados como muestras de plasma de estudio.

Extracción de muestras de calibración de plasma y muestras de estudio de plasma

Todas las muestras de plasma se inocularon con un patrón interno adecuado y se extrajeron con acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 2%. Los sobrenadantes se evaporaron a sequedad bajo nitrógeno y los sólidos restantes se reconstituyeron en agua/acetonitrilo 95/5 (v/v) + 0,2% de ácido fórmico.

Análisis de LC-MS/MS

Los extractos fueron analizados por cromatografía de fase reversa (columna Acquity BEH C18, de 100 x 2,1 mm, 1,7 µm de Waters para el ejemplo 1 y columna Acquity HSS C18 SB, 100 x 2,1 mm, 1,8 µm de Waters para los ejemplos 2, 3, 4, 5 y 6), utilizando las siguientes condiciones: ejemplo 1, fases móviles: (A) agua/acetonitrilo 95/5 (v/v) + 0,1% de ácido fórmico, (B) acetonitrilo/agua 95/5 (v/v) + de ácido fórmico al 0,1%, gradiente: 1% (B) 0-0,1 minutos, 15% (B) 0,1- 2,5 minutos para el ejemplo 1 y 1% (B) 0-0,1 minutos, 40% (B) 0,1-2,5 min para los ejemplos 2, 3, 4, 5 y 6. La detección y cuantificación se realizaron mediante espectrometría de masas, con el interfaz de electrospray en modo positivo y la fragmentación selectiva de analitos (espectrómetro de masas 4000 Trap Q, de AB Sciex).

Evaluación farmacocinética

Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el software WinNonLin® versión 5.3 (Pharsight-A Certara® Company, Moutain View, California 94041 EE.UU.) mediante un análisis de modelo de un compartimento. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron por ajuste de mínimos cuadrados del modelo a los datos experimentales.

Los resultados de los experimentos descritos en 2.8 se indican en las tablas 5a y 5b en el presente documento a continuación.

2.9. Cálculos de carga de fármaco mediante la velocidad de dosis de mantenimiento (velocidad de infusión)

La carga de fármaco para un implante que comprendía un péptido de la presente invención se calculó siguiendo los principios básicos de la farmacocinética (véase también J. Gabrielsson, D. Weiner, “Pharmacokinetics and Pharmaco-dynamics Data Analysis: Concepts and Applications” 4ª edición, Swedish Pharmaceutical Press, Estocolmo, Suecia, 2006), mediante los cuales la velocidad de dosis de mantenimiento (velocidad de infusión, Rin) se puede definir como la velocidad a la que un fármaco debe administrarse para alcanzar un estado estacionario de una cierta dosis en el plasma. La velocidad de dosis de mantenimiento se puede expresar mediante la correlación Rin [g / (h * kg)] = CLiv [L / (h * kg)] x Css,eff [g/l], en la que CLiv es la eliminación (administración i.v.) y Css,eff es la concentración efectiva del fármaco en el plasma en estado estacionario considerando un margen de eficacia A: Css,eff [g/l] = A x (IC50 / fu )x MW [(mol/l) * (g/mol)]. Por lo tanto, la cantidad total de un fármaco cargado en un implante para proporcionar una concentración efectiva constante de ese fármaco en el plasma durante un cierto período de tiempo en un sujeto de un determinado peso corporal se puede calcular mediante la aplicación de la siguiente correlación: Fármacocarga [g/sujeto] = Rin [g / (h * kg)] x duración [h] x PC [kg/sujeto].

Los resultados de los cálculos descritos en 2.9 se indican en la tabla 6 a continuación en el presente documento y en base a los datos dados de las tablas 1, 4 y 5b. Otras condiciones previas son un margen de eficacia de A = 3, una duración del estudio de 672 h (28 días) y un peso corporal de un sujeto humano de 70 kg. La velocidad de filtración glomerular (GFR), que influye principalmente en la eliminación de los péptidos es altamente dependiente de la especie. En general, la velocidad de filtración glomerular de los seres humanos se promedia a 107 ml / (h * kg) en comparación con la velocidad de filtración glomerular del ratón, que es 840 ml / (h * kg). Por lo tanto, los valores CLiv de ratón indicados en la tabla 5b se escalaron alométricamente por 107 ml / (h * kg) / 840 ml / (h * kg) = 0,127 antes de utilizarse en las correlaciones descritas anteriormente.

3.0. Movilización de HSC en ratón

Para los compuestos del ejemplo 1 y el ejemplo 2 se realizó un estudio de la movilización de las HSC que comprende un estudio de tiempos de respuesta para evaluar el momento de máxima movilización después de la dosis y un estudio posterior de dosis-respuesta.

Estudio de tiempo-respuesta

Ratones macho C57BL/6 (Janvier, Francia; n = 5 para el ejemplo 1, n = 3 para el ejemplo 2) recibieron las inyecciones de bolo i. p. del ejemplo 1 y el ejemplo 2, respectivamente, (5 mg/kg) disueltos en 10 l de agua por g de peso de ratón, que contenían el 0,9% de NaCl. Se extrajo sangre de la bolsa de la mejilla en recipientes recubiertos de EDTA en los momentos temporales 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 y 8 horas después de la administración. Los recuentos de unidades de formación de colonias en los cultivos (recuentos UFC-C) se determinaron mediante la realización de un ensayo de UFC-C tal como se describe a continuación. Los resultados del estudio de tiempo-respuesta para el ejemplo 1 y el ejemplo 2 se indican en las tablas 7a y 7b.

Estudio de dosis-respuesta

Ratones machos C57BL/6 (Janvier, Francia; n = 5 por grupo de dosis para el ejemplo 1, n = 3 por grupo de dosis para el ejemplo 2) recibieron las inyecciones de bolo i.p. del ejemplo 1 y el ejemplo 2, respectivamente, a dosis de 0,5, 1,5, 5 y 15 mg/kg (compuesto disuelto en 10 µl de agua por g de peso de ratón que contenía el 0,9% de NaCl). Se extrajo sangre de la bolsa tal como se ha descrito anteriormente en el momento de la movilización máxima para el ejemplo 1 (4 h) y el ejemplo 2 (2 h), respectivamente. Los resultados del estudio de dosis-respuesta para el ejemplo 1 y el ejemplo 2 se indican en las tablas 8a y 8b.

Ensayo de UFC-C

Los recuentos de UFC-C se determinaron mediante el cultivo de alícuotas de sangre periférica lisada en medio de cultivo de células progenitoras semisólido estándar. En resumen, una cantidad definida de sangre se lavó con tampón PBS (Gibco®), que contiene el 0,5% de albúmina de suero bovino, seguido por lisis de glóbulos rojos en tampón hipotónico NH4Cl (Sigma) y una segunda etapa de lavado. El sedimento de células se resuspendió en DMEM (Gibco®) que contenía el 10% de FCS, se suspendió en 2 ml de medio de metilcelulosa repleto de citocina para células murinas disponible comercialmente (Cell Systems, EE.UU.), y se sembraron por duplicado en placas de cultivo celular de 35 mm. El UFC-C se obtuvo después de 7-8 días de incubación en condiciones estándar (20% de O2, humedad saturada, el 5% de CO2, 37°C). La celularidad de sangre periférica se ana lizó utilizando una máquina de recuento sanguíneo automatizado (Drew Scientific).

Curva log10 dosis-respuesta y ED50

Las curvas log10 dosis-respuesta del ejemplo 1 y el ejemplo 2 basadas en los valores de UFC/ml para las dosis de 1,5, 5 y 15 mg/kg, tal como se indica en las tablas 8a y 8b, respectivamente, se muestran en la figura 1 y se ajustan utilizando la función sigmoidal de ajuste de dosis-respuesta en Graph Pad Prism, versión 5.03. Teniendo en cuenta las progresiones de la curva de ambos compuestos, la relación dosis-respuestas están limitadas a una respuesta máxima de 4.000 UFC/ml. Por tanto, los valores de ED50 indicados en la tabla 9 se corresponden a una respuesta de 2.000 UFC/ml.

Tabla 1

Ej. IC50[nM] ± D.E., receptor de CXCR4

1

0,42 ± 0,1

2

0,69 ± 0,43

3

0,11 ± 0,01

4

0,18 ± 0,09

5

0,43 ± 0,24

6

0,09 ± 0,09

Tabla 2

Ej.

Citotoxicidad

Hemólisis a 100 µM [%] GI50 Células HeLa [µM] GI50 Células Cos-7 [µM]

1

>50 >50 1,0

2

>41 >50 1,0

3

>50 >50 1,0

4

>50 >50

5

>50 >50 3,5

6

>50 >50 2

Tabla 3

Ej.

Estabilidad de plasma

Plasma humano cod dejado a T Plasma de ratón cpd dejado a T 1/2 plasma 1/2 Plasma humano 1440 min de ratón 1440 min

1

1440 77 1440 100

2

1440 100 1440 100

3

1440 100 1440 98

4

1440 94 1440

5

1440 92 1440 81

6

1440 83 1440 68

Tabla 4

Ej.

Unión a proteína de plasma [%]

Fracción no unida, fu

1

0,7

2

48 0,52

3

48 0,52

4

56 0,44

5

54 0,46

6

63 0,37

Tabla 5a

Ej. 1 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Ej. 2 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Ej. 3 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Tiempo Conc. Calc.

Número de Conc. Calc.

Número de Conc. Calc.

Número de [h] [ng/ml] animales [ng/ml] animales [ng/ml] animales tomados tomados tomados 0,083 1723 3 1430 2 1168 3 0,25 989 3 1297 3 999 3 0,5 947 3 836 3 442 3

Ej. 1 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Ej. 2 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Ej. 3 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Tiempo Conc. Calc.

Número de Conc. Calc.

Número de Conc. Calc.

Número de [h] [ng/ml] animales [ng/ml] animales [ng/ml] animales tomados tomados tomados 1 373 3 578 3 402 3 2 129 3 234 3 136 3 3 3 68 3 26 3 4 7 3 22 3 12 3

Ej. 4 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Ej. 5 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Ej. 6 ruta i.v. Dosis 1 mg/kg

Tiempo [h] Conc. Calc.

Número de Conc. Calc.

Número de Conc. Calc.

Número de [ng/ml] animales [ng/ml] animales [ng/ml] animales tomados tomados tomados 0,083 1615 3 1313 2 686 3 0,25 869 3 984 3 435 3 0,5 775 3 350 3 215 3 1 504 3 503 3 75 3 2 159 3 150 3 36 3 3 3 49 3 13 3 4 13 3 33 3 7 3

Tabla 5b

ruta i.v.

Ej. 1

Ej. 2

Ej. 3

Ej. 4

Ej. 5

Ej. 6

Dosis [mg/kg] 1 1 1 1 1 1 Vdis [ml/kg] 547 635 762 607 1039 2975 CL [ml/h/kg] 868 659 1113 744 836 2446 AUC0-∞ [ng*h/ml] 1151 1518 898 1345 1196 409 Cmax [ng/ml] 1829 1575 1313 1615 1313 686 Semivida [h] 0,4 0,7 0,5 0,6 0,9 0,8

Tabla 6

Ej.

Peso molecular (libre de sales),

CLiv humana (escalada

Fármacocarga [mg] ± D.E.

P.M. [g/mol]

alométricamente) [ml/h/kg]

1

2054,40 110 19,2 ± 4,6

2

2068,42 84 32,7 ± 20,4

3

1972,25 141 8,3 ± 0,7

4

2042,38 94 11,1 ± 5,5

5

2120,45 106 29,7 ± 16,6

6

2148,51 311 22,9 ± 22,9

Tabla 7a

Línea de

Ej. 1

0,5 h

1h

2h

4h

6h

8h

base

UFC/ml ± D.E. 129 ± 12 511 ± 85 2208 ± 262 2592 ± 450 3109 ± 537 1857 ± 281 588 ± 161

Tabla 7b

Línea de

Ej. 2

0,5 h

1h

2h

4h

6h

8h

base

UFC/ml ± D.E. 242 ± 26 839 ± 148 1020 ± 262 2894 ± 329 1929 ± 643 1164 ± 151 373 ± 96

Tabla 8a

Ej. 1

0 [mg/kg]

0,5 [mg/kg]

1,5 [mg/kg]

5 [mg/kg]

15 [mg/kg]

UFC/ml ± D.E.

129 ± 12 974 ± 57 1672 ± 233 3325 ± 310 3289 ± 431

Tabla 8b

Ej. 2

0 [mg/kg]

0,5 [mg/kg]

1,5 [mg/kg]

5 [mg/kg]

15 [mg/kg]

UFC/ml ± D.E.

242 ± 26 n.d.

1314 ± 463 2894 ± 329 3589 ± 576

Tabla 9

ED50 [mg/kg]

Intervalo de confianza 95%

Ej. 1

1,76 0,57 – 5,39

Ej. 2

2,38 1,15 – 4,89

REIVINDICACIONES

1. Compuesto peptídico de cadena principal ciclada, construido a partir de 16 residuos de aminoácido, de fórmula ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) (I), en la que Xaa3 es Ala, Tyr o Tyr(Me), Tyr(Me) es ácido (2S)-2-amino-(4-metoxifenil)-3-propiónico, Xaa7 es DTyr, DTyr(Me) o DPro, D Tyr(Me) es ácido (2R)-2-amino-(4-metoxifenil)-3-propiónico, o Xaa8 es Dab; u Orn(iPr), Dab es ácido (2S)-2,4-diaminobutírico, Orn(iPr) es ácido (2S)-Nω-isopropil-2,5-diaminopentanoico, Xaa13 es Gln; o Glu, Xaa14 es Lys(iPr), Lys(iPr) es ácido (2S)-Nω-isopropil-2,6-diaminohexanoico, todos los residuos de aminoácidos que no se designan explícitamente como residuos de D-aminoácidos son residuos de L-aminoácidos, y los dos grupos –SH de los dos residuos de cisteína Cys4 y Cys11 están reemplazados por un grupo -S-S-, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

2. Compuesto, según la reivindicación 1, de fórmula I, en la que Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

3. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de fórmula I, en la que Xaa3 es Tyr; o Tyr(Me), Xaa7 es D Pro, Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

4. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de fórmula I, en la que Xaa3 es Ala, Xaa7 es DTyr, Xaa8 es Dab y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

5. Compuesto, según las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula I, en la que Xaa3 es Tyr, Xaa7 es DPro, Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

6. Compuesto, según las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula I, en la que Xaa3 es Tyr(Me), Xaa7 es DPro, Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

7. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de fórmula I, en la que Xaa3 es Ala, Xaa7 es DTyr(Me), Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

8. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de fórmula I, en la que Xaa3 es Tyr, Xaa7 es DTyr, Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

9. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de fórmula I, en la que Xaa3 es Tyr(Me), Xaa7 es DTyr(Me), Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

10. Compuesto, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, de fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, para su utilización como sustancia farmacéuticamente activa, particularmente como sustancia que tiene actividad anticancerígena antagonista de CXCR4 y/o actividad antiinflamatoria y/o actividad movilizadora de células madre.

11. Composición farmacéutica que comprende un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y un portador farmacéuticamente inerte, en particular en una forma adecuada para administración oral, tópica, transdérmica, por inyección, yugal o transmucosa, tal como un comprimido, gragea, cápsula, solución, líquido, gel, apósito, crema, pomada, jarabe, pasta, suspensión, polvo o supositorio.

12. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, como un medicamento que tiene actividad anticancerígena antagonista de CXCR4 y/o actividad antiinflamatoria y/o actividad de movilización de células madre, especialmente para la prevención de infecciones por VIH en individuos sanos; para la ralentización, o detención, de la progresión viral en un paciente infectado por el VIH; para el tratamiento o prevención de un cáncer o una enfermedad inmunitaria, que están mediados por la actividad del receptor CXCR4, o es el resultado de la misma; para el tratamiento de la inmunosupresión; para el acompañamiento de la recolección por aféresis de células madre de sangre periférica; o para la inducción de la movilización de células madre para regular la reparación de tejidos.

13. Utilización de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, para la producción de un medicamento que tiene actividad anticancerígena antagonista de CXCR4 y/o actividad antiinflamatoria y/o actividad de movilización de células madre, especialmente para la prevención de infecciones por VIH en individuos sanos; para la ralentización, o detención, de la progresión viral en un paciente infectado por el VIH; para el tratamiento o prevención de un cáncer o una enfermedad inmunitaria, que están mediados por la actividad del receptor CXCR4, o es el resultado de la misma; para el tratamiento de la inmunosupresión; para el acompañamiento de la recolección por aféresis de células madre de sangre periférica; o para la inducción de la movilización de células madre para regular la reparación de tejidos.

14. Procedimiento para la producción de un compuesto, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de fórmula I, que comprende las etapas de (a) acoplar un soporte sólido funcionalizado con un aminoácido Pro protegido en N, que forma la base del residuo en la posición 16 del compuesto de fórmula I; (b) eliminar el grupo protector de N del producto obtenido de la etapa (a); (c) acoplar el producto de la etapa (b) con un aminoácido protegido en N DPro, que forma la base del residuo en la posición 15 del compuesto de fórmula I; (d) eliminar el grupo protector de N del producto obtenido en la etapa (c); (e) adicionar, de una manera análoga a la que se describe en las etapas (c) y (d), cada uno de los residuos de aminoácidos deseados en las posiciones 14 a 1 del compuesto de fórmula I, uno después del otro, al grupo amino libre del residuo de aminoácido que está, en cada caso, en el extremo libre de la cadena peptídica creciente acoplada al soporte sólido, estando el aminoácido deseado que se utiliza, en cada caso, en la etapa de acoplamiento análoga a la etapa (c) protegido en N y estando también protegido cualquier grupo funcional presente en dicho aminoácido deseado, diferente del grupo carboxilo de la fracción de alfa-amino; (f) reemplazar los dos grupos –SH de los dos residuos de cisteína del producto de la etapa (e) por un grupo -S-S-, a menos que el grupo –S-S- se forme en la etapa (j); (g) separar el hexadecapétipdo del soporte sólido; (h) acoplar el residuo de aminoácido de la posición 1 del hexadecapétido con el residuo de aminoácido de la posición 16 del hexadecapéptido; (i) desproteger cualquier grupo funcional protegido presente en el producto de la etapa (h); (j) reemplazar los dos grupos –SH de los dos residuos de cisteína del producto de la etapa (i) por un grupo -S-S-, a menos que el grupo –S-S- se forme en la etapa (f); (k) si se desea, fijar uno o varios sustituyentes isopropilo al producto de la etapa (j) (l) desproteger cualquier grupo funcional protegido presente en el producto de la etapa (k); y (m) convertir un compuesto de fórmula I en forma libre en el correspondiente compuesto de fórmula I en forma de sal farmacéuticamente aceptable, si el producto deseado del procedimiento es un compuesto de fórmula I en forma de sal farmacéuticamente aceptable, o convertir un compuesto de fórmula I en forma de sal farmacéuticamente aceptable en el correspondiente compuesto de fórmula I en forma libre, si el producto deseado del procedimiento es un compuesto de fórmula I en forma libre, o en el compuesto correspondiente de fórmula I en forma de sal farmacéuticamente aceptable diferente, si el producto deseado del procedimiento es un compuesto de fórmula I en forma de sal farmacéuticamente aceptable diferente.