Método para la selección de células neuronales en función de su diferenciación mediante exposición a flubendiamida.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la selección de células neuronales en cultivo en función de su diferenciación,

a través del establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de distintas concentraciones de flubendiamida a varios grupos de células neuronales. De aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de la población de células neuronales en diferenciación para fines investigadores y/o terapéuticos, como por ejemplo en la investigación sobre el efecto de factores o sustancias del ámbito medioambiental, agroalimentario, químico, farmacéutico, etc, y en terapias antitumorales o neuro-regenerativas.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201100471.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: FERNANDEZ SANCHEZ, MARIA TERESA, NOVELLI CIOTTI, ANTONELLO, VARGIU,Simona, CABONI,Pierluigi.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07C317/50 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07C COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos macromoleculares C08; producción de compuestos orgánicos por electrolisiso electroforesis C25B 3/00, C25B 7/00). › C07C 317/00 Sulfonas; Sulfóxidos. › en que al menos uno de los átomos de nitrógeno forma parte de uno de los grupos en que X es un heteroátomo e Y un átomo cualquiera.
  • C12N5/0793 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Neuronas.

PDF original: ES-2390789_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

MÉTODO PARA LA SELECCIÓN DE CÉLULAS NEURONALES EN FUNCIÓN DE SU DIFERENCIACIÓN MEDIANTE EXPOSICIÓN A FLUBENDIAMIDA

La presente invención se refiere a un método para la selección de células neuronales en función de su nivel de diferenciación.

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de la población de células neuronales en diferenciación para fines investigadores y/o terapéuticos, como por ejemplo en la

1 O investigación sobre el efecto de factores o sustancias del ámbito medioambiental, agroalimentario, químico, farmacéutico, etc., y en terapias antitumorales o neuroregenerativas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las células neuronales adultas representan el grado máximo de diferenciación celular. Durante el proceso de diferenciación, adquieren todas las propiedades que, oportunamente integradas, permiten el funcionamiento del sistema nervioso. El proceso de diferenciación neuronal es consecuentemente un momento crítico para el correcto funcionamiento del sistema nervioso y, particularmente en el ser humano,

para el desarrollo de sus facultades mentales. Fallos en la diferenciación neuronal durante el desarrollo embrionario humano conllevan importantes deficits cognitivos en la vida posnatal cuando ésta es posible, y fallos en la diferenciación neuronal de células madres del sistema nervioso central adulto pueden dar lugar a la formación de tumores particularmente agresivos e incapacitantes.

Existen múltiples técnicas para la selección de células en función de su grado de diferenciación. Cada técnica aprovecha metodologías diferentes (fisicas, biofisicas, químicas, farmacológicas, inmunológicas, etc.) asociadas con peculiares características génicas, bioquímicas, fisiológicas, que pueden satisfacer muchas necesidades experimentales. Sin embargo es laborioso y complejo aislar poblaciones

de células neuronales durante su desarrollo in vitro ya que se necesitan aparatos

•'

específicos, tales como un "cell-sorter", que no están siempre al alcance de todos los laboratorios, y esto obliga los investigadores de varios grupos a compartir los aparatos disponibles aumentando los problemas técnicos inherentes (limpieza, esterilidad, calibración, etc) y el tiempo necesario para conseguir la población neuronal deseada.

Además, esto se obtiene sólo en células neuronales que todavía no se hayan adherido a una superficie de cultivo y no hayan iniciado su desarrollo morfológico, bioquímico y fisiológico, de tal manera que no es posible aprovechar estos factores en la selección de las células neuronales .

1 O DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A los efectos de la presente invención y su descripción, la flubendiamida es 3iodo-N'- (2-mesil-1, 1-dimetiletil) -N-{ 4-[ 1 , 2, 2, 2-tetrafluoro-1- (trifluorometil) etil]-otolil} ftalimida.

El método objeto de la presente invención se basa en que la exposición a la

flubendiamida de una población de células nerviosas con distinto grado de diferenciación, induce la muerte de las células neuronales menos diferenciadas. Con este método es posible: 1) determinar el número de células nerviosas que consigue una diferenciación más rápida en respuesta a distintos tratamientos físicos, químicos y farmacológicos; 2) obtener cultivos neuronales más homogéneos en sus propiedades

fisiológicas; 3) reducir la variabilidad de la respuesta celular a la exposición a sustancias de interés fármaco-toxicológico; 4) seleccionar poblaciones neuronales resistentes a la flubendiamida para el estudio de los mecanismos de resistencia con el fin de aprovecharlos terapéuticamente.

La presente invención se refiere a un método para seleccionar células 25 neuronales en función de su grado de diferenciación que comprende los siguientes parámetros y etapas:

• Parámetros:

1) número de días del cultivo primario.

2) tiempo de exposición a flubendiamida.

30

3) concentraciones de flubendiamida.

..

• Etapas:

a) Establecimiento de 5 grupos (A, B, C, D, E) de células neuronales, en su primer, 2°, 4°, 6° y 8° día en cultivo respectivamente, donde cada grupo debe constar de no menos de 2 placas del mismo cultivo (A', A";

B' B"· C' C"· D' D"· E' E")

' ' ' ' ' ' ' .

b) Establecimiento de una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 ¡..tM, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que, siguiendo el esquema indicado en la Tabla I como ejemplo para el grupo A, se obtienen los grupos: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. hasta E, [20], 96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida.

e) Detección de los efectos citotóxicos inducidos por la flubendiamida en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos.

d) Identificación de la concentración de flubendiamida que produce el máximo efecto tóxico en relación a la edad de las células y al tiempo de exposición en cultivo, para su posterior utilización en la selección de poblaciones de células neuronales en cultivos destinados a la investigación.

e) Interrupción del tratamiento con flubendiamida en cultivos destinados a la investigación mediante lavado de las células previamente tratadas utilizando una solución fisiológica.

Tabla 1: Ejemplo, para el grupo A, de organización de grupos en función del tiempo de exposición a la flubendiamida y la concentración de la misma.

Grupo A Tiempo de exposición a la flubendiamida (h) Concentración de flubendiamida (~M) 12 24 48 72 96 o A[0]12 A[0]24 A[0]48 A[0]72 A[0]96 1 A[1]12 A[1]24 A[1]48 A[1]72 A[1]96 2 A[2]12 A[2]24 A[2]48 A[2]72 A[2]96 5 A[5]12 A[5]24 A[5]48 A[5]72 A[5]96 10 A[10]12 A[10]24 A[10]48 A[10]72 A[10]96 20 A[20]12 A[20]24 A[20]48 A[20]72 A[20]96 5 En una realización preferida, las células neuronales son neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario. En una realización más preferida, las neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario son neuronas granulares de cerebelo de rata. 1 O 15 En una realización específica, la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase. En una realización más específica. En una realización más específica, la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia. En una realización aún más específica, la detección de los efectos citotóxicos y la cuantificación de los niveles de viabilidad celular se realizan transcurridas 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde la adición de flubendiamida. En otra realización específica, la progresión de los efectos del tratamiento con flubendiamida se interrumpe mediante lavado de las células con medio de cultivo. En una realización más específica, el lavado de las células se realiza utilizando medio de cultivo procedente de células no tratadas de la misma edad. 20

su La aplicación del presente método para la selección de neuronas en función de diferenciación requiere una inversión mínima ya que la mayor parte de los

..

laboratorios en la actualidad dispone de instalaciones para cultivos celulares dotadas de: - Una campana de flujo laminar. - Un incubador de C02. 5 -Un microscopio de contraste de fases con epifluorescencia. 1 O El procedimiento de la presente invención se sitúa entre las técnicas que se aprovechan... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

l. Procedimiento para la selección de células neuronales en cultivo en función de su diferenciación, que comprende las siguientes etapas:

a) establecimiento de 5 grupos (A, B, C, D, E) de células neuronales, en su 1 er, 2°, 4°, 6°, 8° día en cultivo respectivamente, donde cada grupo debe constar de no menos de 2 placas del mismo cultivo (A' A"· B' B"· C' C"· D' D"· E'

' ' ' ' ' ' ' ' '

E") ;

b) establecimiento de una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 J..LM, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que se obtienen los grupos: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. hasta E, [20], 96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida.

e) detección de los efectos citotóxicos inducidos por flubendiamida en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos;

d) identificación de la concentración de flubendiamida que produce el máximo efecto tóxico en relación a la edad de las células en cultivo y al tiempo de exposición para su posterior utilización en la selección de poblaciones de células neuronales en cultivos destinados a la investigación;

e) interrupción del tratamiento con flubendiamida en cultivos destinados a la investigación mediante lavado de las células previamente tratadas utilizando una solución fisiológica.

2. Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que las células neuronales son neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario.

3. Procedimiento, según reivindicación 2, caracterizado por que las neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario son neuronas granulares de cerebelo de rata.

4. Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase.

5. Procedimiento, según reivindicación 4, caracterizado por que la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia.

6. Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que el lavado de las

células se realiza utilizando medio de cultivo procedente de células no tratadas 1 O de la misma edad.


 

Patentes similares o relacionadas:

Imagen de 'Forma cristalina de los enantiómeros ópticos de modafinilo'Forma cristalina de los enantiómeros ópticos de modafinilo, del 9 de Marzo de 2016, de Teva Santé: El uso de la forma polimórfica del enantiómero levógiro o dextrógiro de modafinilo, designada forma I, caracterizada porque (i) produce un espectro de difracción X que incluye […]

PROCEDIMIENTO PARA LA CRISTALIZACIÓN DE LA BICALUTAMIDA, del 22 de Noviembre de 2011, de SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED: Procedimiento para la cristalización de bicalutamida, que comprende la adición a agua de una solución de acetona que contiene bicalutamida

DIPEPTIDOS DE OXAMILO C-TERMINALES MODIFICADOS COMO INHIBIDORES DE LA FAMILIA DE CISTEINA PROTEASAS ICE/CED-3., del 16 de Junio de 2007, de IDUN PHARMACEUTICALS, INC.: Un compuesto de la siguiente **fórmula**, en la que: A es un aminoácido natural o no natural B es un átomo de hidrógeno, un átomo de deuterio, alquilo, cicloalquilo, fenilo, […]

DERIVADOS AMIDAS, SULFONAMIDAS O CARBAMATOS AROMATICOS DE ACRILONITRILO Y COMPOSICIONES COSMETICAS FOTOPROTECTORAS QUE LOS CONTIENEN., del 16 de Marzo de 2006, de L'OREAL: Composición cosmética para uso tópico, destinada en particular a la fotoprotección de la piel y/o de los ca bellos, que contiene, en un vehículo cosméticamente […]

DERIVADOS DE DIAMIDA AROMATICA O SALES DE ESTOS DERIVADOS, PRODUCTOS QUIMICOS PARA LA AGRICULTURA/HORTICULTURA Y PROCEDIMIENTO DE UTILIZACION DE ESTOS PRODUCTOS., del 16 de Septiembre de 2005, de NIHON NOHYAKU CO., LTD.: Un derivado de diamida aromático representado por la siguiente fórmula general (I) o una sal del mismo: {donde A1 es un grupo alquileno C1-C8; un grupo alquileno […]

ACIDOS BETA-TIOCARBOXILICOS SUSTITUIDOS., del 1 de Septiembre de 2005, de RHONE-POULENC RORER PHARMACEUTICALS INC.: LA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS DE FORMULA GENERAL (I), DONDE R 1 Y R 3 PUEDEN SER IGUALES O DISTINTOS Y CADA UNO INDEPENDIENTEMENTE REPRESENTA UN GRUPO […]

MATGERIAL DE GRABACION SENSIBLE AL CALOR., del 1 de Abril de 2005, de CIBA SPECIALTY CHEMICALS HOLDING INC.: Un material de grabación sensible al calor, que consta de: a) por lo menos un compuesto cromógeno y b) por lo menos un revelador de la **fórmula** […]

Imagen de 'DERIVADOS DE HIDROXIALQUILAMINAS COMO INHIBIDORES DE LA BETA-SECRETASA…'DERIVADOS DE HIDROXIALQUILAMINAS COMO INHIBIDORES DE LA BETA-SECRETASA Y SU USO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y ENFERMEDADES SIMILARES, del 1 de Diciembre de 2008, de ELAN PHARMACEUTICALS, INC. PHARMACIA & UPJOHN COMPANY: Un compuesto de fórmula (Ver fórmula) o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que A3 y A4 son independientemente F, Cl, Br, I, metilo, etilo, metoxi, […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .