MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN DE ANTÍGENOS CELULARES T CD4+.

[0001] La presente invención se refiere a un método de identificación antígenos celulares T CD4+. Las células T (TC) CD4+ juegan un papel principal en la orquestación de las respuestas inmunes adaptativas. Al proporciona ayuda en forma de citoquinas secretadas o señales de la superficie celular, las TC inician y controlan las funciones humorales específicas de antígeno y efectoras celulares y mantienen la memoria inmunológica. De este modo, la identificación de antígenos reconocidos por las TC es esencial para entender y modular las respuestas inmunes adaptativas. Las TC reconocen complejos de péptido /MHC II en la superficie de células presentadoras de antígenos profesionales (pAPC), por ejemplo, macrófagos, células B y células dendríticas (DC). Los péptidos presentados en moléculas MHC de clase II derivan mayoritariamente de proteínas exógenas o de membrana celular procesadas en el compartimento endosómico /lisosómico. [0002] Existen dos clases de moléculas MHC, la clase I y la clase II, que se diferencian funcionalmente por el tipo de antígeno al que se unen y el subgrupo de células T con los que interaccionan. La dicotomía entre las moléculas de clase I y la clase II se refiere a sus diferentes papeles en la activación de células T. Las moléculas de clase I presentan péptidos a los linfocitos T citotóxicos (CTL) positivos de CD8 limitados a MHC de clase I. Estas células lisan directamente las células diana. Dado que las moléculas de clase I son expresadas por casi todas las células nucleadas, los CTL son capaces de reconocer y destruir prácticamente cualquier célula si presenta el complejo MHC/péptido apropiado. Por otro lado, las moléculas de clase II presentan péptidos a células T CD4+, la función primaria de las cuales es secretar citoquinas y expresar moléculas de la superficie celular que inducen actividades de otros linfocitos, incluyendo células B, macrófagos y CTL. Juegan un papel dominante en la orquestación de una respuesta inmune. [0003] Se deseó durante mucho tiempo identificar aquellos antígenos que podrían conducir a una activación de TC a efectos de inducir o evitar respuestas inmunes. [0004] En el pasado, se han desarrollado métodos diferentes para la identificación de antígenos reconocidos por TC. Se han identificado dos antígenos tumorales reconocidos por TC específicas de melanomas mediante la purificación bioquímica de proteínas antigénicas de lisados tumorales combinados con la secuenciación por espectrometría de masas (Monach et al., 1995; Pieper et al., 1999). En esta estrategia, las fracciones de proteínas obtenidas mediante métodos de separación bioquímica se añaden a cultivos de APC, que captan, procesan y presentan estos antígenos exógenos en MHC de clase II, donde se pueden reconocer por TC específicas de antígeno. Las fracciones positivas se separan posteriormente, y por último el antígeno reconocido por las TC es identificado por espectrometría de masas en fracciones positivas altamente purificadas. Dado que las proteínas difieren en su comportamiento bioquímico, el procedimiento de purificación debe ajustarse para cada antígeno. Además, el equipo técnico altamente sofisticado requerido para la identificación de antígenos excluye una aplicación más amplia de esta estrategia. [0005] Los intentos por aislar péptidos antigénicos directamente de las moléculas MHC de clase II aplicados para la identificación de péptidos reconocidos por TC mediante el análisis de secuencia de espectrometría de masas han sido insatisfactorios en la mayoría de los casos para péptidos reconocidos por TC. A diferencia de las moléculas MHC de clase I, el surco de unión del péptido de las moléculas de clase II presenta extremos abiertos y acomoda péptidos heterogéneos de longitud. Sin embargo, se identificó un péptido derivado de gp100 utilizando esta estrategia (Halder et al., 1997). [0006] Se han identificado varios antígenos de TC específicas de melanoma mediante una estrategia de clonación de la expresión de ADNc modificado desarrollada originalmente para identificar antígenos tumorales limitados a MHC de clase I (De Plaen et al., 1997; Wang et al., 1999a; Wang et al., 1999b). Para superar las diferencias en la presentación de antígenos, los ADNc se fusionaron al gen de cadena invariante. Las secuencias señal en los primeros 80 aminoácidos de cadena invariante dirigen las proteínas de fusión resultantes en el compartimento endosómico/lisosómico donde tiene el lugar el procesamiento y carga en las moléculas de MHC de clase II (Fujii et al., 1998; Sanderson et al., 1995; van Bergen et al., 1997). Como línea celular receptora para la expresión de bibliotecas de ADNc, las células HEK293 altamente transfectables se modificaron genéticamente para convertirse en pAPC artificiales. Las células se transfectaron de forma estable con ADNc que codifica HLA-D y -Dß, que forman el elemento de restricción de la MHC de clase II apropiado, HLA-DM y -DMß, que facilitan la unión de péptidos a moléculas MHC de clase II, y la cadena invariante, que dirige moléculas MHC de clase II recién sintetizados en el compartimento de procesado y carga de MHC de clase II (Wang et al., 1999b). Este método depende del conocimiento de la molécula MHC limitante y requiere la transfección estable de células HEK293 con cinco genes diferentes. 2   [0007] La metodología más reciente desarrollada para la identificación de antígenos de TC es mediante la clonación de expresión bacteriana. Se utilizó una biblioteca de expresión fagos establecida a partir de ADN genómico de tuberculosis de Mycobacterium por Alderson et al. Para la identificación de antígenos reconocidos por TC específicas para este patógeno humano (Alderson et al., 2000). Las células dendríticas (DC) o macrófagos se incubaron con E. coli infectado con antígenos micobacterianos que expresan fagos . Después de la fagocitosis de las bacterias completas, los péptidos derivados de proteínas expresadas bacterialmente se presentan en moléculas MHC de clase II. Mediante la sonda de estas APC con TC, se identificaron las bacterias individuales que expresan los antígenos. [0008] Recientemente se aplicó una estrategia similar para definir el antígeno reconocido por TC específica de antígeno menor de histocompatibilidad (mHA) (Sahara y Shastri, 2003). En lugar de fagos , se expresó una biblioteca de plásmidos de ADNc en E. coli y se alimentaron conjuntos de bacterias transformadas en DC. Utilizando un antígeno modelo, se verificó recientemente la viabilidad y sensibilidad de esta estrategia con líneas celulares linfoblastoides (LCL) transformadas por EBV humano como APC y bacterias opsonizadas con complemento, dando lugar a la detección del antígeno modelo en grupos de 300 bacterias que expresan proteínas irrelevantes (van de Corput et al., 2005). Sin embargo, sólo una pequeña proporción de genes eucariotas se expresan en niveles suficientemente elevados en bacterias para permitir tamaños de grupo tan grandes. Debido a que la mayoría de las proteínas se expresan en niveles significativamente inferiores, muchos antígenos permanecerán no detectados con esta estrategia. [0009] Sanderson et al describe en la Identificación de un antígeno estimulante de células T CD4+ de bacterias patogénicas por la clonación de la expresión, Journal of Experimental Medicine, vol. 182, no. 6, Diciembre 1995, un método de identificación de antígenos celulares T CD4+ que comprende proporcionar un ácido nucleico que codifica un antígeno de células que expresan antígenos o tejido y obtener fragmentos antigénicos de dicho ácido nucleico, y expresar uno o más de dichos fragmentos en una célula huésped adecuada. Los fragmentos antigénicos son de un tamaño de 1-4 kb y no se expresan como proteínas de fusión con un marcador adecuado. [0010] Por lo tanto, Un problema subyacente en la presente invención es proporcionar un método mejorada de identificación de antígenos de células auxiliares T. Un objeto adicional de la invención es identificar y proporcionar antígenos de células auxiliares T desconocidos hasta ahora. Estos problemas se resuelven por la materia de la reivindicación independiente 1. Las realizaciones preferidas se establecen en las reivindicaciones dependientes. [0011] En resumen, la presente invención proporciona las siguientes ventajas y resultados: [0012] Los inventores desarrollaron un procedimiento simple y fiable para localizar epítopos en antígenos y para la identificación de los mismos. Se describe una estrategia simple y rápida de clonación de la expresión de ADNc bacteriano que permite la identificación rápida de antígenos de células auxiliares T. Los fragmentos antigénicos cortos creados mediante la digestión con enzimas de restricción de corte frecuente se unen al azar a la secuencia codificante... [Seguir leyendo]

1. Método de identificación de antígenos celulares T CD4+ que comprende las etapas de a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un antígeno de células que expresan antígeno o tejido y obtener fragmentos antigénicos de dicho ácido nucleico, donde los fragmentos tienen un tamaño que varía de 25 a 300 pb, preferiblemente de 40 a 200 pb, y, lo más preferible, aproximadamente 90 pb; b) expresar uno o más de dichos fragmentos como una proteína de fusión que comprende dicho fragmento y un marcador en una célula huésped adecuada, donde la célula huésped se selecciona entre células bacterianas; c) poner en contacto dicha célula que expresa la proteína de fusión con células presentadoras de antígenos (APC) y cocultivar con células T CD4+ específicas de antígeno: d) determinar si las células T CD4+ son activadas por dichas células que expresan la proteína de fusión. 2. Método según la reivindicación 1, en el que los fragmentos se obtienen mediante la separación del ácido nucleico que codifica el antígeno con una o más enzimas de restricción de corte frecuente que se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en AciI, MnII, BsaJI, CviJI o digerido con nucleasas, por ejemplo, DNAsel. 3. Método según una o más de las reivindicaciones 1-2, en el que dichos fragmentos se expresan como una proteína de fusión introduciendo un vector de expresión, preferiblemente un plásmido, que contiene la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el fragmento y un marcador, en la célula huésped. 4. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que el gen marcador se selecciona entre genes de resistencia a antibióticos, preferiblemente cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), entre genes marcadores fluorescentes, que codifican preferiblemente proteína fluorescente verde o roja, o LacZ. 5. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico que codifica el antígeno es ADNc obtenido mediante la transcripción de ARNm aislado de las células que expresan antígeno o tejido en ADNc. 6. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que las APC se seleccionan entre células dendríticas, macrófagos y linfocitos, preferiblemente de una línea celular linfoblastoide (LCL). 7. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende además expander las células huésped reconocidas por las células T CD4+ específicas de antígeno e identificar los fragmentos antigénicos mediante análisis de secuencia. 8. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que la activación de dichas células T CD4+ se mide determinando la secreción o proliferación de citoquinas. 9. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que el antígeno deriva de bacterias, origen viral, de bibliotecas de ADNc o de tejido de pacientes, por ejemplo, explantes de tumores en el caso de pacientes con tumores o tejidos inflamados en los casos de autoinmunidad o infección. 10. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que las células T CD4+ específicas de antígeno se aislan mediante una estimulación in vitro de células estimuladoras autólogas, donde las células T CD4+ se aíslan de sangre periférica, órganos linfoides secundarios (por ejemplo, nódulo linfático) o tejido de pacientes (por ejemplo, explantes de tumores en el caso de pacientes con tumores o tejidos inflamados en los casos de autoinmunidad o infección). 26   Figura 1 Tinción con Coomassie® Transferencia Western 27   Figura 2 28 Proteína rel. + irrel. Bacterias rel. + irrel. APC + Células T   Figura 3 Grupo D1 Grupo F10 29   Figura 3C Grupo H5   Figura 4 Grupo B12 31   Figura 5 32   Figura 6 33   Figura 7 34   Figura 8   Figura 9 36   Figura 10 37 Sin bacterias   Figura 11 Sin proteínas 38   Figura 12 Placa de ensayo DANI #2, 60 cfu/pocillo cribada con clon C1-9 de células T 39   Figura 13 Placa de ensayo DANI #3 con 60 cfu/pocillo y células T C1-9, 4.1.05   Figura 14 Prueba de colonias bacterianas individuales del grupo positivo 3/E3 con células T C1-9, 8.1.05 41