Método para aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar interacciones proteicas.

Un método para aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar una interacción entre un ligando proteico x conocido y un ligando proteico y conocido en el interior de una célula

, que comprende las etapas de:

a) obtener una cepa de levadura recombinante en la que:

i) una secuencia que codifica el ligando proteico x y una secuencia que codifica el ligando proteico y se clonan en un primer vector de expresión de levadura, pero

ii) al menos uno de x o de y se expresa de manera inducible, y

iii) la interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y conduciría a la producción de un represor de una función esencial de la célula de levadura o de un agente tóxico, de modo que se obtendrían células de levadura no viables;

b) transformar la cepa de levadura recombinante del punto a) con una biblioteca de expresión de anticuerpos intracelulares por medio de un segundo vector de expresión de levadura;

c) seleccionar una cepa de levadura recombinante transformada del punto b) induciendo la expresión tanto del ligando x como del ligando y; y aislando clones de levadura receptores capaces de crecer;

d) aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar la interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y de los clones de levadura recombinantes receptores capaces de crecer, en donde la biblioteca de expresión de los anticuerpos intracelulares se obtiene de linfocitos de ratones no inmunizados y se expresa directamente en las células de levadura sin utilizar el cribado de presentación de fagos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IT2003/000764.

Solicitante: Rottapharm Biotech S.r.l.

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: Via Valosa di Sopra 3 20052 Monza ITALIA.

Inventor/es: CATTANEO, ANTONINO;, VISINTIN, MICHELA;.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/18 (contra materiales animales o humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)

PDF original: ES-2526612_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar interacciones proteicas La presente invención se refiere a un método para el aislamiento de anticuerpos intracelulares estables capaces de neutralizar interacciones proteicas. En particular, la invención se refiere a una biblioteca de fragmentos de anticuerpo para aislar y expresar anticuerpos funcionales en el ambiente intracelular (anticuerpos intracelulares) , capaces de interaccionar con proteínas diana específicas en el ambiente intracelular. La invención se refiere a un método para el aislamiento de un conjunto de fragmentos de anticuerpo contra una parte significativa de las interacciones proteínaproteína de una célula dada (interactoma) o contra las interacciones proteicas que constituyen una ruta o red intracelular.

Se sabe que los anticuerpos pueden usarse para interferir de una manera altamente específica con procesos biológicos dentro de la célula (Cattaneo y Biocca 1997) (Cattaneo y Biocca 1999) (Biocca, Neuberger et al. 1990) . Una expresión intracelular específica puede dar como resultado la inhibición de la función proteica diana (anulación proteica) . De esta manera, un anticuerpo intracelular adecuado puede conferir un fenotipo de interés a una célula o a un organismo. En particular, la anulación proteica representa un método ventajoso para aprovechar y resolver el cuello de botella en genómica funcional (de genes a función) . De hecho, los programas genómicos y proteómicos proporcionan una gran cantidad de información para la identificación de genes y proteínas pero no de su función. La solución del problema de la técnica anterior podría facilitar la identificación y validación de proteínas diana también para el desarrollo de fármacos. La anulación proteica tiene ventajas notables con respecto a métodos alternativos (anulación génica o anulación de ARN, antisentido, ribozimas o ARNi) (Rossi 1999; Capecchi 1989; Fire 1999; Tavernarakis, Wang et al. 2000) ya que:

- la proteína está directamente correlacionada con su función biológica;

- permite anular versiones modificadas después de la transducción de la proteína o las subpoblaciones

compartimentalizadas de la proteína;

- permite la modulación de la intensidad de anulación (anulación gradual o silenciamiento) . Dado que la función

proteica depende con mucha frecuencia de las interacciones proteína-proteína específicas, los anticuerpos o

fragmentos de anticuerpo capaces de interferir con las interacciones proteína-proteína permitirán una

neutralización de la función proteica selectiva y específica, permitiendo a la vez otras funciones de la misma

proteína, dependiendo de otras interacciones proteicas.

La tecnología de anticuerpos intracelular puede ser extremadamente útil para genómica funcional ya que aprovecha:

- un repertorio prácticamente limitado de los anticuerpos contra cualquier proteína; -la posibilidad de dirigir estos anticuerpos a sitios en los que la proteína ejerce su función dentro de la célula, y -la posibilidad de obtener una anulación proteica específica y localizada.

Sin embargo, su aplicación a la genómica funcional y a la proteómica global requiere la tecnología simplemente en un proceso de alto rendimiento. Por eso la tecnología de anticuerpos intracelulares no es aplicable en la actualidad a la genómica funcional.

La tecnología de anticuerpos intracelulares usa genes para anticuerpos específicos que se modifican adecuadamente y se obtienen del sistema inmunitario natural (de ratón o humano) o de bibliotecas de anticuerpos (sintéticas o naturales) expuestas en las superficies de fagos filamentosos como fragmentos de anticuerpo (tecnologías de presentación de fagos, ScFv) .

Con respecto a afinidad, estabilidad y solubilidad, la calidad de los fragmentos de anticuerpo aislados con tecnología de presentación de fagos es proporcional al tamaño de la biblioteca usada para selección in vitro (Vaughan, Williams et al. 1996) , ya que la probabilidad de hallar un anticuerpo con las propiedades de interés es proporcional a la diversidad de la biblioteca. Por esto es necesario tener grandes bibliotecas de anticuerpos para obtener anticuerpos de alta afinidad capaces de reconocer cualquier antígeno (Griffiths, Malmqvist et al. 1993) (Griffiths, Williams et al. 1994) (Sheets, Amersdorfer et al. 1998) (Vaughan, Williams et al. 1996) (Sblattero y Bradbur y 2000) . Estas bibliotecas se ensayan con los antígenos de interés, ligados en la fase sólida; los anticuerpos se seleccionan después por ciclos secuenciales de absorción, lavado, elución y crecimiento. Este procedimiento de selección, sin embargo, no asegura que los anticuerpos seleccionados sean adecuados para la expresión intracelular, ya que no todos los anticuerpos son capaces de actuar en el ambiente intracelular. En el estado actual de la técnica, el rendimiento de los anticuerpos adecuados para expresión intracelular no es predecible a priori (Biocca, Ruberti et al. 1995; Proba, Worn et al. 1998) , ya que las condiciones físico químicas intracelulares (de citoplasma y núcleo) difieren en gran medida de en las que los anticuerpos se encuentran en la naturaleza y se sintetizan normalmente (rutas de retículo endoplásmico y secretoras) .

Por lo tanto, una aplicación de la tecnología a la genómica funcional requiere un método robusto y predecible para seleccionar a priori anticuerpos capaces de actuar en el ambiente intracelular. Se ha conseguido una mejora con el método de selección basado en un sistema de doble híbrido (IACT o Tecnología de Captura de Anticuerpos

Intracelulares) (Visintin et al. 1999; Visintin et al. 2002) y se describe en la solicitud de patente internacional PCT WO 00/54057. Los anticuerpos en el formato de IACT son capaces de interaccionar con el antígeno correspondiente y resultan ser eficaces y funcionales cuando se expresan como anticuerpos intracelulares ordinarios en el sistema de usuario final. La estrategia de selección por IACT es eficaz en el diagnóstico y predicción para la identificación de anticuerpos intracelulares funcionales partiendo de bibliotecas grandes. La tecnología IACT también se ha usado en un procedimiento derivado para identificar rápida y eficazmente los epítopos reconocidos por los anticuerpos seleccionados en sus antígenos respectivos (mapeo de epítopos in vivo, IVEM, solicitud de patente RM2000A00561) (Visintin et al. 2002) .

Sin embargo, el desarrollo de IACT no permite aún aplicar la tecnología de anticuerpos intracelulares a genómica funcional, lo que requiere un rendimiento paralelo de al menos 500 a 1000 genes hasta varios miles de genes. Además, el procedimiento de IACT no asegura que los fragmentos de anticuerpos seleccionados sean capaces de neutralizar la función de la proteína diana. Solamente un subconjunto de los anticuerpos seleccionados, como mucho tendrán la propiedad de ser anticuerpos neutralizantes.

La solución a este problema constituye el objetivo de la invención, que permite un procesamiento rápido, eficaz de alto volumen de genes para anticuerpos intracelulares validados que se expresan después en modelos celulares apropiados para estudiar y neutralizar la función de proteínas correspondientes.

En una implementación específica, el procedimiento descrito en la presente invención permite el aislamiento directo de fragmentos de anticuerpo capaces de alterar específicamente interacciones proteína-proteína, que tienen de este modo la capacidad de neutralizar selectiva y específicamente la función proteica. Por lo tanto, el procedimiento descrito permite aislar fragmentos de anticuerpo que se validan intracelularmente y neutralizan la función proteica.

Como ya... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar una interacción entre un ligando proteico x conocido y un ligando proteico y conocido en el interior de una célula, que comprende las etapas de:

a) obtener una cepa de levadura recombinante en la que:

i) una secuencia que codifica el ligando proteico x y una secuencia que codifica el ligando proteico y se clonan en un primer vector de expresión de levadura, pero ii) al menos uno de x o de y se expresa de manera inducible, y iii) la interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y conduciría a la producción de un represor de una función esencial de la célula de levadura o de un agente tóxico, de modo que se obtendrían células de levadura no viables;

b) transformar la cepa de levadura recombinante del punto a) con una biblioteca de expresión de anticuerpos intracelulares por medio de un segundo vector de expresión de levadura; c) seleccionar una cepa de levadura recombinante transformada del punto b) induciendo la expresión tanto del ligando x como del ligando y; y aislando clones de levadura receptores capaces de crecer; d) aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar la interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y de los clones de levadura recombinantes receptores capaces de crecer, en donde la biblioteca de expresión de los anticuerpos intracelulares se obtiene de linfocitos de ratones no inmunizados y se expresa directamente en las células de levadura sin utilizar el cribado de presentación de fagos.

2. Un método para aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar una interacción entre un ligando proteico 25 x conocido y un ligando proteico y conocido en el interior de una célula, que comprende las etapas de:

a) obtener una cepa de levadura recombinante que tiene una competencia sexual mat-a o mat-alfa en la que:

i) una secuencia que codifica el ligando proteico x y una secuencia que codifica el ligando proteico y se clonan en un primer vector de expresión de levadura, pero ii) al menos uno de x o y se expresa de una manera inducible, y iii) la interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y conduciría a la producción de un represor de una función esencial de la célula de levadura o de un agente tóxico, de modo que se obtendrían células de levadura no viables;

b) obtener una biblioteca de expresión de anticuerpos intracelulares por medio de un segundo vector de expresión de levadura en una cepa de levadura con una competencia sexual opuesta a la de la cepa de levadura en el punto a) ; c) exponer las levaduras del punto a) y las levaduras recombinantes del punto b) a condiciones capaces de promover el apareamiento sexual y la expresión de los ligandos x e y; d) seleccionar clones de levadura transformados induciendo la expresión tanto del ligado x como del ligando y; y asilando receptores de clones de levadura capaces de crecer; e) aislar anticuerpos intracelulares capaces de neutralizar la interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y de los clones de levadura recombinantes receptores capaces de crecer, en donde la biblioteca de 45 expresión de anticuerpos intracelulares se obtiene de linfocitos de ratones no inmunizados y se expresa directamente en las células de levadura sin utilizar el cribado de presentación de fagos.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la cepa de levadura recombinante se obtiene por:

a) clonación de una primera secuencia que codifica el ligando proteico x y una segunda secuencia que codifica el ligando proteico y en el primer vector de expresión de levadura, estando cada primera y segunda secuencias bajo el control de cada una de las dos partes de los promotores bidireccionales, estando la primera secuencia fusionada a una secuencia que codifica una primera molécula, y estando la segunda secuencia fusionada a una 55 secuencia que codifica una segunda molécula, de modo que cuando el ligando proteico x y el ligando proteico y interaccionan se induce la producción de un represor de una función esencial de la célula de levadura o de un agente tóxico; b) transformación de la cepa de levadura receptora con el vector de expresión de levadura del punto a) ; y c) selección de las levaduras transformadas.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 en el que los promotores bidireccionales son los promotores Gal 1 y Gal 10.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 en el que la primera y la segunda moléculas conducen a la 65 producción de un represor capaz de suspender la transcripción del gen de levadura HIS3.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la biblioteca de expresión de anticuerpos intracelulares se obtiene en un formato de anticuerpo de un único dominio o scFv

7. Un método para identificar simultáneamente tanto un ligando proteico x capaz de unirse a un ligando proteico y

conocido en el interior de una célula eucariota, como un anticuerpo intracelular capaz de neutralizar dicha interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y conocido, que comprende las etapas de:

a) clonar una biblioteca de ADNc que contenga secuencias que codifiquen el ligando proteico x y una secuencia que codifique el ligando proteico y en un primer vector de expresión de levadura, estando las secuencias de la 10 biblioteca de ADNc bajo el control de una de las dos partes de un promotor inducible bidireccional, estando las secuencias de la biblioteca de ADNc fusionadas a una secuencia que codifica una primera molécula; y estando la secuencia que codifica el ligando proteico y bajo el control de la otra de las dos partes del promotor bidireccional, y estando fusionada a una secuencia que codifica una segunda molécula, de tal manera que cuando el ligando proteico x y el ligando proteico y interaccionan dicha primera molécula y dicha segunda molécula interaccionan también, de una manera que se induce la producción bien de un represor de una función esencial de la célula de levadura o de un agente tóxico; b) transformar una cepa de levadura con una competencia sexual mat-a o mat-alfa con el primer vector de expresión de levadura recombinante del punto a) ; c) seleccionar las levaduras transformadas;

d) obtener una biblioteca de expresión de anticuerpos intracelulares en una cepa de levadura que tiene una competencia sexual opuesta a la de la cepa de levadura del punto a) mediante un segundo vector de expresión de levadura; e) someter las levaduras del punto c) y las levaduras del punto d) a condiciones tales que se promueve la reproducción sexual y la expresión del promotor bidireccional en un entorno capaz de inducir la expresión del

ligando proteico x y del ligando proteico y; f) seleccionar clones de levadura viables en los que el anticuerpo intracelular altera la interacción entre el ligando proteico x y el ligando proteico y; g) identificar el ligando proteico x y el anticuerpo intracelular,

en el que la biblioteca de expresión de anticuerpos intracelulares se obtiene de linfocitos de ratones no inmunizados y se expresa directamente en las células de levadura sin utilizar el cribado por presentación de fagos.

Cribado II: