Identificación mediada por trasposición de proteínas de unión o funcionales específicas.

Un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada, que comprende:

(i) generar una colección diversa de polinucleótidos, preferentemente vectores plasmídicos o amplicones de PCR, de ADN bicatenario, que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido dispuesto entre una primera y una segunda secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella;

(ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en las células hospedadoras;

(iii) expresar en la células hospedadoras al menos una enzima transposasa funcional con dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas, de modo que dicha colección diversa de polinucleótidos se integre en el genoma de la célula hospedadora para proporcionar una población de células hospedadoras que exprese dicha colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que presentan diferentes especificidades de unión y funcionalidades;

(iv) explorar dichas células hospedadoras para identificar una célula hospedadora que expresa un polipéptido con una especificidad de unión o funcionalidad deseada; y

(v) aislar la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de dicha célula hospedadora.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12178529.

Solicitante: NBE-Therapeutics LLC.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: Technology Parc Basel, Hochbergerstrasse 60C 4057 Basel SUIZA.

Inventor/es: GRAWUNDER, ULF.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/90 (Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma)

PDF original: ES-2528892_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Identificación mediada por trasposición de proteínas de unión o funcionales específicas Antecedentes de la invención Campo de la invención (a) Tecnologías para la identificación de proteínas de unión y funcionales específicas El descubrimiento de proteínas específicas de diana, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, es de interés comercial significativo, ya que la selección de proteínas funcionales o proteínas de unión altamente selectivas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, tiene un alto potencial para el desarrollo de nuevas entidades biológicas (NBE) con nuevas propiedades terapéuticas que se integran muy específicamente, o interfieren con procesos biológicos, y por lo tanto se predice que presentan perfiles de efectos secundarios menores que las nuevas entidades químicas (NCE) convencionales. A este respecto, particularmente el desarrollo de anticuerpos terapéuticos, altamente específicos de diana, y productos terapéuticos basados en anticuerpos, han allanado el camino para terapias completamente nuevas con eficacia mejorada. Como consecuencia, los anticuerpos monoclonales terapéuticos representan el segmento de crecimiento más rápido en el desarrollo de nuevos fármacos durante la última década, y en la actualidad generan aproximadamente 50.000 millones de dólares americanos en ingresos globales, lo que representa un porcentaje significativo del mercado global total de los fármacos. Página adicional 1a.

Por lo tanto, hay mucha demanda de tecnologías eficaces e innovadoras, que permitan el descubrimiento de proteínas altamente terapéuticas, pero también bien toleradas, en particular productos terapéuticos basados en anticuerpos.

Para identificar una proteína con una funcionalidad deseada o una propiedad de unión específica, como sucede para anticuerpos, se requiere generar, expresar funcionalmente y explorar grandes colecciones diversas, o bibliotecas de proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con respecto a propiedades funcionales deseadas o especificidad de unión a diana. Se han desarrollado varias tecnologías durante últimos los veinte años, que permiten la expresión de diversas bibliotecas de proteínas bien en células hospedadoras, o bien en partículas virales y de fago y métodos para su exploración de alto rendimiento y/o selección de una propiedad funcional deseada, o fenotipo de unión.

En Kempeni, Ann Rheum Dis 1999, 58 (sup. I) 170-2, se analizan los resultados preliminares de ensayos clínicos tempranos con anticuerpo monoclonal anti-TNF alfa completamente humano D2E7.

Además, Urban et al., Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Nº 4 analiza la presentación de fragmentos de Fv monocatenarios expresados en la superficie de partículas retrovirales por fusión con una proteína de envoltura retroviral y selección de agentes de unión de fragmentos Fv monocatenarios seleccionando partículas retrovirales para una proteína de unión deseada. No está relacionado con la presentación de anticuerpos de longitud completa en la superficie de células de mamífero.

Las tecnologías del estado de la técnica, convencionales, para conseguir identificación de agentes de unión específicos de diana o proteínas con propiedades funcionales deseadas incluyen, por ejemplo, presentación de fagos, presentación retroviral, presentación bacteriana, presentación de levadura y diversas tecnologías de presentación de células de mamífero, en combinación con unión a superficie sólida (selección) y/u otras técnicas de enriquecimiento. Todas estas tecnologías están abarcadas por diversas patentes y solicitudes de patente pendientes.

Aunque se han establecido sistemas de presentación de fagos y procariotas y están ampliamente adoptados en la industria biotecnológica y en la academia para la identificación de agentes de unión específicos de diana, incluyendo fragmentos de anticuerpo (Hoogenboom, Nature Biotechnology 23, 1105-1116 (2005) ) , padecen diversas limitaciones, incluyendo la incapacidad de expresar versiones de longitud completa de proteínas mayores, incluyendo anticuerpos de longitud completa, la falta de la modificación post-traduccional apropiada, la falta de plegamiento apropiado por chaperonas de vertebrados y, en el caso de anticuerpos, una combinación de cadena pesada y ligera forzada artificialmente. Por lo tanto, en el caso del descubrimiento de anticuerpos por estos métodos, se requiere el “cambio de formato” a anticuerpos de longitud completa y expresión en células de mamífero. Debido a las limitaciones anteriormente mencionadas esto da como resultado con frecuencia anticuerpos con propiedades biofísicas desfavorables (por ejemplo baja estabilidad, tendencia a agregarse, afinidad reducida) , que limitan el potencial terapéutico y diagnóstico de dichas proteínas. Esto, por un lado, conduce a tasas de desgaste significativas en el desarrollo de moléculas candidatas generadas por estos métodos y, por otro lado, requiere un esfuerzo significativo para corregir las desventajas biofísicas y moleculares en estas proteínas para desarrollo farmacológico corriente abajo adicional.

Por lo tanto, se han desarrollo tecnologías de descubrimiento de proteínas y anticuerpos usando sistemas de expresión de células eucariotas inferiores (por ejemplo, levadura) y, más recientemente, también de mamíferos para la identificación de proteínas con propiedades deseadas, ya que estas tecnologías permiten (i) la expresión de proteínas mayores, de longitud completa, incluyendo anticuerpos de longitud completa, (ii) modificación posttraduccional mejor o normal y (iii) en el caso de anticuerpos formación de pares de cadena pesada-ligera apropiada (Beerli y Rader, mAbs 2, 365-378 (2010) ) . Esto selecciona además proteínas con propiedades biofísicas favorables que tienen un mayor potencial en el desarrollo farmacológico y uso terapéutico.

Aunque sería más deseable la expresión y exploración de proteínas de células de vertebrados, debido a que las células de vertebrados (por ejemplo, células CHO de hámster, HEK-293 humanas o DT40 de pollo) son sistemas de expresión preferidos para la producción de proteínas terapéuticas mayores, tales como anticuerpos, estas tecnologías se asocian también en la actualidad con varias limitaciones, que han conducido a una adopción lenta de estas tecnologías en la academia y la industria.

En primer lugar, las células de vertebrados no se modifican genéticamente de forma tan eficaz y estable como, por ejemplo, las células procariotas o eucariotas inferiores como levadura. Por lo tanto, sigue siendo un reto generar bibliotecas de proteínas basadas en células de vertebrados suficientemente diversas (complejas) , de las que puedan identificarse candidatos con propiedades deseadas o afinidades de unión mayores. En segundo lugar, para aislar eficazmente proteínas con propiedades deseadas, se requieren habitualmente ciclos por iteraciones de enriquecimiento celular. La expresión de vertebrados por transfección transitoria de plásmidos (Higuchi et al J. Immunol. Methods 202, 193-204 (1997) ) , o sistemas de expresión viral transitorios, como virus sindbis o vaccinia (Beerli et al. PNAS 105, 14336-14341 (2008) , y documento WO02102885) no permiten múltiples ciclos de selección celular requerida para enriquecer eficazmente proteínas altamente específicas, y estos métodos se restringen por lo tanto a la exploración de bibliotecas pequeñas, pre-enriquecidas, de proteínas o requieren ciclos de aislamiento de virus/re-infección celular tediosos.

Para conseguir una expresión estable de proteínas de unión y anticuerpos de células de vertebrados, que permitan múltiples ciclos de selección basándose en el acoplamiento de genotipo-fenotipo estable,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada, que comprende:

(i) generar una colección diversa de polinucleótidos, preferentemente vectores plasmídicos o amplicones de PCR, de ADN bicatenario, que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido dispuesto entre una primera y una segunda secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella;

(ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en las células hospedadoras;

(iii) expresar en la células hospedadoras al menos una enzima transposasa funcional con dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas, de modo que dicha colección diversa de polinucleótidos se integre en el genoma de la célula hospedadora para proporcionar una población de células hospedadoras que exprese dicha colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que presentan diferentes especificidades de unión y funcionalidades;

(iv) explorar dichas células hospedadoras para identificar una célula hospedadora que expresa un polipéptido con una especificidad de unión o funcionalidad deseada; y

(v) aislar la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de dicha célula hospedadora.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichos polinucleótidos comprenden a) una secuencia de unión a ligando de un receptor o una secuencia de unión a diana de una molécula de unión, b) una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo, c) una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, d) una secuencia que codifica una región VH de un anticuerpo y una región VL de un anticuerpo, e) una secuencia que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa,

o un fragmento de unión a antígeno de la misma, y/o f) una secuencia que codifica un dominio Fv monocatenario o uno Fab.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que la generación de dicha colección diversa de polinucleótidos comprende someter secuencias génicas de región V a PCR en condiciones de mutación.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que la etapa (ii) comprende introducir en dichas células hospedadoras polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican

a) regiones VH o VL de inmunoglobulina, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, y en el que dichas secuencias de región VH y VL se codifican en vectores separados y/o b) cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina de longitud completa, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, en donde dichas secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa están en vectores separados, c) un vector que comprende secuencias que codifican cadenas VH y VL de anticuerpo. d) un vector que comprende secuencias que codifican una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y una cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dicha etapa de expresión

(iii) comprende introducir en dichas células hospedadoras un vector de expresión que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas, en donde dicha enzima transposasa se expresa preferentemente de forma transitoria en dicha célula hospedadora.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dicha etapa de exploración (iv) comprende separación de células activadas magnéticamente (MACS) , separación de células activadas por fluorescencia (FACS) , selección frente a moléculas inmovilizadas en una superficie sólida, selección con respecto a unión con moléculas asociadas a membrana celular incorporadas en una membrana de bicapa lipídica celular, natural o artificialmente reconstituida, o exploración de alto rendimiento de clones celulares individuales en formato multi-pocillo con respecto a un fenotipo funcional o de unión deseado.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dicha etapa (v) de aislar la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada comprende amplificación genómica o por RT-PCR o secuenciación profunda de siguiente generación.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que

a) dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas son del sistema de transposón PiggyBac o del sistema de transposón Sleeping Beauty y/o b) la etapa (iii) comprende introducir en dicha célula hospedadora un vector que comprende una secuencia que codifica una transposasa PiggyBac o transposasa Sleeping Beauty funcionales.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas se reconocen por y son funcionales con al menos una transposasa seleccionada del grupo que consiste en: PiggyBac, Sleeping Beauty, Frog Prince, Himar1, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, Ac/Ds, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR y Hsmar1.

10. Una biblioteca de moléculas polinucleotídicas que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, que comprende una pluralidad de moléculas polinucleotídicas, preferentemente plásmidos o amplicones de PCR de ADN bicatenario, en donde dichas moléculas polinucleotídicas comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella.

11. Una biblioteca de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dichos polinucleótidos comprenden

a) al menos una secuencia que codifica una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo, b) una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, c) una secuencia que codifica una región VH de anticuerpo y una región VL de anticuerpo, d) una secuencia que codifica una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, e) una secuencia que codifica un dominio Fv monocatenario o uno Fab.

12. Una biblioteca de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, en la que dichos plásmidos o amplicones de PCR de ADN bicatenario comprenden además una secuencia que codifica una enzima transposasa que reconoce las secuencias de repeticiones terminales invertidas y es funcional con ellas.

13. Un método para generar una biblioteca de polinucleótidos transponibles que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidad, que comprende generar una colección diversa de polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella.

14. Un vector que comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella.

15. Una célula hospedadora que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Un método para generar una población de células hospedadoras capaces de expresar polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, que comprende:

(i) generar una colección diversa de polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella; y

(ii) introducir dicha colección diversa de polinucleótidos en células hospedadoras.

17. El método o el vector de acuerdo con las reivindicaciones mencionadas 2-16, en el que el vector que comprende la secuencia VH comprende secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por una enzima transposasa diferente de las secuencias de repeticiones terminales invertidas en el vector que comprende la secuencia VL.

18. Un método o una célula hospedadora de acuerdo con las reivindicaciones mencionadas 1-12, 15-17, en donde las células hospedadoras son células de vertebrados, preferentemente células de mamífero, más preferentemente células humanas o de roedores, aún más preferentemente células linfoides, aún más preferentemente linfocitos B, incluso más preferentemente linfocitos B progenitores o linfocitos B precursores, particularmente preferentemente linfocitos B progenitores o linfocitos B precursores transformados con virus de la leucemia murina de Abelson y linfocitos proB y preB humanos transformados con VEB sin inmunoglobulina, tempranos.