COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN POLIPEPTIDOS.

Una composición que comprende un polipéptido que comprende al menos dos sitios de unión a antígeno,

en la que dichos al menos dos sitios de unión a antígeno están localizados en una cadena polipeptídica sencilla, y en la que

• uno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD3 humano;

• dicho polipéptido puede existir tanto en forma monomérica como en forma multimérica, siendo dicha forma monomérica dicha cadena polipeptídica sencilla y comprendiendo dicha forma multimérica al menos dos de dichas cadenas polipeptídicas sencillas asociadas no covalentemente entre sí; y

• dicha forma multimérica de dicho polipéptido constituye no más del 5% del peso total de las formas monomérica y multimérica combinadas de dicho polipéptido

Composiciones que comprenden polipéptidos.

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden polipéptidos, especialmente polipéptidos capaces de unirse específicamente a antígenos predeterminados por medio de epítopes en dichos antígenos. Una composición preferida es una composición farmacéutica. La presente invención también se refiere a un procedimiento de producción de una composición enriquecida en la que la cantidad de un polipéptido en forma monomérica se ha enriquecido respecto a otras formas multiméricas del polipéptido. La presente invención también se refiere a una composición enriquecida producida por el procedimiento anterior. La presente invención se refiere además a procedimientos para la prevención, tratamiento o mejora de diversas enfermedades. Por último, la presente invención se refiere al uso de composiciones para producir un medicamento para la prevención, tratamiento o mejora de estas diversas enfermedades.

Con la llegada de procedimientos normalizados de producción de polipéptidos y proteínas recombinantes, dichas especies recombinantes se están empleando cada vez más como agentes terapéuticos activos en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de patologías humanas. Dado el número de compañías, organizaciones de investigación y laboratorios universitarios que se están embarcando en el desarrollo de polipéptidos y proteínas terapéuticas recombinantes, sólo cabe esperar que el número de composiciones medicinales en las que el efecto terapéutico sea atribuible a un polipéptido o proteína producida de forma recombinante aumente en el futuro.

Debido a su alta afinidad y selectividad de unión, las inmunoglobulinas ("Ig") o anticuerpos representan una clase especialmente relevante de proteínas de alto potencial terapéutico. Han sido de un interés particular en los últimos años los anticuerpos de cadena sencilla producidos de forma recombinante tanto en formas monoespecíficas como biespecíficas. Se desvelan anticuerpos monoespecíficos de cadena sencilla, por ejemplo, en el documento US 4.946.778. Se desvela un anticuerpo de cadena sencilla biespecífico, por ejemplo, en el documento US 5.091.513. Dichos anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos pueden ser de una importancia terapéutica particular, puesto que las dos funcionalidades diferentes dentro de dicha especie pueden reunir espacialmente in vivo de forma selectiva y eficaz dos epítopes diferentes, es decir, en la mayoría de los casos dos antígenos diferentes. Debido al hecho de que una molécula de cadena sencilla biespecífica une dos sitios de unión a antígeno en una sola cadena polipeptídica contigua, dichas moléculas superan los problemas de la capacidad de producción recombinante experimentados por Ig completas debido, por ejemplo, a que estas últimas comprenden una parte Fc.

Ha sido de un interés terapéutico particular el desarrollo de anticuerpos producidos de forma recombinante, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que son capaces de unirse específicamente al antígeno CD3 humano.

El antígeno CD3 está presente tanto en células T auxiliares como en células T citotóxicas. Estas últimas, en concreto las células T citotóxicas, son responsables de la destrucción de células invasoras o infectadas contra las que se han activado las células T citotóxicas. El CD3 humano denota un antígeno que se expresa en células T como parte del complejo multimolecular de células T y que comprende tres cadenas diferentes: CD3-épsilon, CD3-delta y CD3-gamma.

La activación del potencial citotóxico de las células T es un fenómeno complejo que requiere la interacción de múltiples proteínas. La proteína receptora de célula T ("TCR") es un heterodímero unido a disulfuro unido a membrana constituido por dos subunidades glucoproteicas diferentes. El TCR reconoce y se une a un antígeno peptídico extraño que por sí mismo se ha unido por un miembro de la muy diversa clase de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad ("MHC") y se ha presentado, unido al MHC, en la superficie de células presentadoras de antígeno ("APC").

Aunque el TCR variable se une a un antígeno extraño como se ha resumido anteriormente, la señalización a la célula T de que esta unión ha tenido lugar depende de la presencia de otras proteínas de señalización invariantes asociadas con el TCR. Estas proteínas hbox{de señalización en forma asociada se denominan en su conjunto el complejo CD3.}

En resumen, la activación de la citotoxicidad de células T depende normalmente en primer lugar de la unión del TCR con una proteína de MHC, unida por sí misma a un antígeno extraño, localizada en una célula separada. Sólo cuando ha tenido lugar esta unión inicial TCR-MHC puede seguirse de la cascada de señalización dependiente de CD3 responsable de la expansión clonal de células T y, en última estancia, de la citotoxicidad de células T.

Sin embargo, se ha descubierto anteriormente que ciertos sitios de unión a antígeno polipeptídicos producidos de forma recombinante que se unen específicamente a al menos parte del antígeno CD3 humano tienen la capacidad de activar células T para ejercer un efecto citotóxico sobre otras células en ausencia de unión TCR-MHC independiente. Esto significa que las células T pueden activarse citotóxicamente de una forma clonalmente independiente, es decir, de una forma que es independiente del clon de TCR específico que lleva la célula T. Esto permite una activación de todo el compartimento de células T en lugar de sólo células T específicas de una identidad clonal determinada. Dichas moléculas se han desvelado en los documentos EP 1348715; WO 99/54440; Mack, J. Immunol. (1997) 158, 3965-70; Mack, PNAS (1995) 92, 7021-5; Kufer, Cancer Immunol. Immunother. (1997) 45, 193-7; Löffler, Blood (2000) 95, 2098-103; Brühl, J. Immunol. (2001) 166, 2420-6.

El tipo de actividad biológica descrito anteriormente, es decir, la capacidad de un polipéptido para (re)dirigir selectivamente el potencial citotóxico de células T citotóxicas contra células diana predeterminadas de modo que se lisen estas últimas puede ser de una gran importancia terapéutica. En concreto, composiciones de polipéptidos tales como los descritos en el párrafo anterior pueden usarse y se han usado eficazmente como parte de un régimen de terapia que supone la destrucción de células diana asociadas con enfermedades particulares. En particular, dichas enfermedades incluyen estados cancerosos en los que las células transformadas son las células diana destinadas a su destrucción.

Además de tener la clase de actividad biológica descrita anteriormente, es decir, la capacidad de dirigir la citotoxicidad de células T a las células diana destinadas a su destrucción, las composiciones que comprenden polipéptidos de la clase descrita anteriormente manifestarán a menudo otros tipos adicionales de actividades biológicas no relacionadas con la lisis de células diana. Dichas actividades biológicas adicionales pueden o no ser beneficiosas y, si dicha composición está destinada a la administración a un paciente, es posible que compliquen la construcción de un régimen terapéutico. Por lo tanto, sería deseable eliminar dichos tipos adicionales de actividades biológicas en la mayor medida en que sea posible en dicha composición, de modo que el tipo de actividad biológica manifestada por la composición resultante permanezca tan homogéneo como sea posible.

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar una composición que supere las dificultades anteriores.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición con un polipéptido. El polipéptido comprende al menos dos sitios de unión a antígeno, en el que dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se localizan en una sola cadena polipeptídica y en el que

1. Una composición que comprende un polipéptido que comprende al menos dos sitios de unión a antígeno, en la que dichos al menos dos sitios de unión a antígeno están localizados en una cadena polipeptídica sencilla, y en la que

2. La composición de la reivindicación 1, en la que al menos uno de los dos sitios de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo (VH) y una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo (VL).

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el otro sitio de unión a antígeno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD19 humano o al antígeno EpCAM humano.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que el otro sitio de unión a antígeno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD19 humano y en la que dicho polipéptido tiene una secuencia como se representa en cualquiera de las SEC ID Nº: 1-6 o una secuencia que tiene una homología de al menos el 70% con cualquiera de las SEC ID Nº: 1-6.

5. Un procedimiento de producción de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la cantidad de un polipéptido en forma monomérica se ha enriquecido respecto a la cantidad de dicho polipéptido en forma multimérica, en el que

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que las etapas (b2) y/o (c2) se realizan por medio de cromatografía en una columna o por medio de un procedimiento discontinuo, en el que se prefiere que las etapas (b2) y (c2) se realicen en una columna.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho segundo material cromatográfico permite la separación basándose en el intercambio aniónico.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que dicho lavado de las etapas b2 y c2 se realiza usando un volumen de primer y/o segundo tampón que es de 6 a 10 veces superior al volumen del primer y/o segundo material cromatográfico, respectivamente.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que dicha translocación de la etapa d2 se realiza por aplicación de un volumen de dicho tampón de procesamiento equivalente a de 3 a 7 veces el volumen del tercer material cromatográfico.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en el que dicho primer y segundo tampón son cada uno tampón fosfato a pH 8.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en el que dicho tampón de procesamiento de la etapa d2 se selecciona de tampón fosfato a pH 7,0-7,5 y tampón citrato/lisina a pH 6,0-7,5.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-11, que comprende además la etapa o etapas de analizar la composición enriquecida en el polipéptido en forma monomérica obtenida en la etapa f para obtener una medica de la cantidad de dicho polipéptido en forma monomérica respecto a la cantidad de polipéptido en forma multimérica en dicha composición y, opcionalmente, que comprende además la etapa de enriquecer el contenido de polipéptido en forma monomérica respecto al contenido de polipéptido en forma multimérica por repetición de las etapas d a f en dicha composición enriquecida en el polipéptido en forma monomérica.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-12, en el que dicho análisis se realiza usando un procedimiento cromatográfico que separa sustancias basándose en su peso molecular.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho procedimiento cromatográfico es cromatografía de exclusión por tamaño, en particular, cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-14, en el que

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho imidazol se aplica en una concentración de 80 mM y/o dicho cloruro sódico se aplica en una concentración de 400 mM.

18. Una composición que puede obtenerse por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-17.

19. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o de la reivindicación 18 para producir un medicamento para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, de un cáncer mínimo residual, de una enfermedad tumoral, de una enfermedad inflamatoria, de un trastorno inmunológico, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad infecciosa, de una enfermedad vírica, de una reacción alérgica, de una reacción parasitaria, de una enfermedad de injerto contra huésped, de una enfermedad de huésped contra injerto o de un tumor maligno de células B.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que la prevención, tratamiento o mejora de la enfermedad o trastorno se produce en un ser humano.

21. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en el que dicha enfermedad tumoral se selecciona del grupo constituido por un linfoma, una leucemia de células B o un linfoma de Hodgkin.

22. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en el que dicho tumor maligno de células B es un linfoma no Hodgkin.

23. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistemático, psoriasis, esclerodermia y enfermedades tiroideas autoinmunes.