ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA EL RECEPTOR DE TIPO II DE HORMONA ANTIMULLERIANA HUMANA (AMHR-II).

Un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por receptor de tipo II de hormona antimulleriana humana (AMHR-II) que comprende:

(a) una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 para CDR-1, la SEQ ID NO: 3 para CDR-2 y la SEQ ID NO: 4 para CDR-3; y (b) una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6 para CDR-1, la SEQ ID NO: 7 para CDR-2 y la SEQ ID NO: 8 para CDR-3

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y a fragmentos de los mismos dirigidos contra el receptor de tipo II de hormona antimulleriana humana (AMHR-II) y a su uso para tratar y diagnosticar enfermedades cancerosas tales como cánceres de ovario.

El cáncer de ovario es la causa principal de malignidad ginecológica y es la quinta causa más común de muerte relacionada con cáncer en mujeres. Con una incidencia media de aproximadamente 10 por 100.000, un total de 1-2% de todas las mujeres europeas presentan un cáncer de ovario en algún punto de sus vidas (Black RJ y col. 1997).

Los tumores de células de la granulosa (TCG) dan cuenta de aproximadamente un 5% de los neoplasmas malignos del ovario y de un 70% de los tumores ováricos estromales de los cordones sexuales. Aunque su malignidad potencial es relativamente baja en los primeros años de la enfermedad, puede aparecer recurrencia hasta 30 años después de la eliminación quirúrgica de los tumores primarios (Singh-Ranger G y col. 2004). Si el diagnóstico se hace tempranamente, antes de que el tumor se haya extendido al peritoneo, el pronóstico de recurrencia puede mejorar significativamente con la eliminación quirúrgica completa (Dutertre M. y col., 2001).

Los cánceres epiteliales del ovario representan aproximadamente un 80% de todos los tumores de ovario. Cuando estos carcinomas se diagnostican en etapas tempranas, la tasa de supervivencia es de aproximadamente un 90%. Desgraciadamente, en el diagnóstico, aproximadamente un 75% de las mujeres tienen ya una diseminación intraabdominal de la enfermedad (“American Cancer Society Facts and Figures”. 2001 www.cancer.org). En estos casos, la tasa de supervivencia es de aproximadamente un 20-25% a pesar del tratamiento apropiado (Rapkiewicz AV. y col. 2004).

Se han propuesto algunos marcadores moleculares para cáncer epitelial del ovario, especialmente la forma de antígeno canceroso 125 en circulación (CA125 o MUC16), que se sobreexpresa en aproximadamente un 80% de estos tumores. Sin embargo, la elevación de su nivel puede estar asociada a la menstruación y a afecciones benignas tales como endometriosis o enfermedad hepática.

Las estrategias terapéuticas principales usadas para cáncer epitelial del ovario son cirugía y quimioterapia. Por ejemplo, el cáncer de ovario se ha tratado generalmente con quimioterapia basada en cisplatino, pero a menudo recidiva debido a resistencia a cisplatino adquirida (Yahata, H. y col., 2002). Aunque la mayoría de pacientes pueden responder inicialmente a la quimioterapia con platino y paclitaxel, incluyendo respuestas completas, la tasa de recaída es de aproximadamente un 85% (Gordon AN y col. 2004). Se han desarrollado rápidamente nuevas terapias orientadas basadas en hormonas, factores antiangiogénicos y anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales incluyen oregovomab (OvaRex, AltaRex), un anticuerpo monoclonal de murino en investigación dirigido contra CA125, usado actualmente en ensayos clínicos como tratamiento inmunoterapéutico (Berek JS y col. 2004) y cetuximab, que está dirigido contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), expresado en 30 a 70% de los cánceres epiteliales del ovario (Ozols RF y col. 2004).

Por tanto, existe una importante necesidad de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer de ovario. Adicionalmente, hay una clara necesidad de identificar nuevas proteínas asociadas al cáncer de ovario para uso como biomarcadores sensibles y específicos para el diagnóstico de cáncer de ovario en sujetos vivos.

El receptor de tipo II de hormona antimulleriana está implicado en la regresión del conducto de Muller asociada al desarrollo del sistema reproductivo masculino. Este receptor se expresa frecuentemente en células de tumor epitelial del ovario humanas. Ya que se ha demostrado la capacidad de la AMH de inhibir el crecimiento de células de cáncer de ovario, el AMHR-II podría constituir por tanto una diana valiosa para inmunoterapia basada en anticuerpo.

Se ha estudiado la expresión de AMHR-II en modelos animales mediante la manipulación genética de la línea germinal de ratón. Dutertre y col. (2001) notificaron la expresión de un AMHR-II funcional en tumores de ovario de células de granulosa derivados de ratones transgénicos obtenidos mediante oncogénesis orientada usando una construcción oncogénica de SV40 promotora de AMH. En un modelo de ratón desarrollado recientemente, Conolly y col. (2003), usando una construcción del mismo oncogén bajo el control de la secuencia reguladora en dirección 5' de AMHR-II, demostraron que aproximadamente un 50% de los ratones femeninos desarrollaban cáncer epitelial del ovario. Masiakos y col. (1999) demostraron también la expresión de AMHR-II en líneas celulares de cáncer epitelial del ovario, en muestras de células ascíticas aisladas de pacientes y en tumores sólidos de pacientes con carcinoma de ovario. Estos investigadores notificaron también la expresión de AMHR-II en líneas de células cancerosas derivadas de otros tejidos tales como mama (Segev DL y col.; 2000) o próstata (Segev DL y col. 2002). Estos datos sugieren un perfil muy específico de AMHR-II en cánceres humanos, especialmente en tumores de ovario.

En 2004, Salhi y col. desarrollaron y caracterizaron un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido contra AMHR-II humano, y demostraron mediante inmunohistoquímica (IHC) la fuerte expresión de AMHR-II por tumores de células de granulosa humanos (GCT) y por células de Sertoli y Leydig en testículos humanos. Mostraron también claramente la unión no competitiva del mAb 12G4 en tumores de células de granulosa que expresan un alto nivel del ligando natural (AMH), permitiendo por tanto el uso in vivo del mAb 12G4 en tumores que expresan AMHR-II.

Más recientemente, Yuan y col. (2006) describieron la selección de moléculas de scFv (fragmentos variables monocatenarios) humanas específicas de AMHR-II de una colección expuesta en fago de scFv no inmunitarios. Sugirieron adicionalmente que las construcciones basadas en anticuerpo pueden proporcionar un medio altamente específico de orientarse a AMHR-II en células de carcinoma de ovario humano con el fin de diagnosticar y tratar esta enfermedad.

La solicitud internacional WO2005/005615 describe anticuerpos que tienen una afinidad de unión específica por el receptor de tipo II de sustancia inhibidora de los conductos de Müller (MISIIR), en particular anticuerpos Fv monocatenarios, y el uso de los mismos para tratar o diagnosticar cánceres.

La presente invención da una fuente disponible públicamente del anticuerpo monoclonal específico desarrollado por Salhi y col. (2004), que se designa por los inventores como mAb 12G4. Es más, se ha depositado un hibridoma productor del mAb 12G4 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia), según los términos del Tratado de Budapest, el 26 de septiembre de 2006. El hibridoma depositado tiene el número de depósito CNCM I-3673. Los inventores han clonado y caracterizado también el dominio variable de las cadenas ligera y pesada de dicho mAb 12G4, y determinado por tanto las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo.

Además, los inventores han investigado mediante inmunohistoquímica usando el mAb 12G4 la expresión de AMHR-II en secciones de tejido de diversos tumores. Por lo tanto, han demostrado el perfil de expresión específico de AMHR-II en cánceres de ovario, no solo en cánceres epiteliales del ovario, sino también en subtipos especiales tales como adenocarcinoma seroso y transparente y tumores de células de granulosa adultas, que pertenecen respectivamente a las proliferaciones epiteliales malignas y a los tumores estromales de los cordones sexuales. Por tanto, mostraron que el AMHR-II podía representar un nuevo marcador de diagnóstico para cánceres positivos de AMHR-II y que podía usarse como diana para inmunoterapia, usando el mAb 12G4 o derivados del mismo.

Los inventores han demostrado recientemente mediante experimentos de inmunofluorescencia que el mAb 12G4 muestra una internalización eficaz en la línea celular de TCG transfectada establemente con AMHR-II (COV434-pIRES-EGFP-AMHR-II) (Zhang H y col. 2000). Esta línea celular expresa aproximadamente 104 receptores/célula. Han mostrado también la capacidad in vitro de este anticuerpo de inhibir el crecimiento de células COV434 que expresan AMHR-II. Se han efectuado también experimentos in vivo, mostrando... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por receptor de tipo II de hormona antimulleriana humana (AMHR-II) que comprende:

(a) una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 para CDR-1, la SEQ ID NO: 3 para CDR-2 y la SEQ ID NO: 4 para CDR-3; y

(b) una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6 para CDR-1, la SEQ ID NO: 7 para CDR-2 y la SEQ ID NO: 8 para CDR-3.

2. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 que comprende:

(a) un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 1; y

(b) un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 5.

3. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de murino.

4. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo es obtenible a partir del hibridoma accesible con el número de depósito de la CNCM I-3673.

5. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico de ratón/humano.

6. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

7. Un fragmento de un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, seleccionado del grupo constituido por los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

8. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un fragmento del mismo según la reivindicación 7.

9. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Una célula hospedadora que se ha transformado por un ácido nucleico según la reivindicación 8 y/o un vector según la reivindicación 9.

11. La célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que dicha célula es la célula YB2/0 disponible en el número de depósito de la ATCC CRL1662.

12. Un procedimiento de producción de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

o de un fragmento del mismo según la reivindicación 7, comprendiendo dicho procedimiento las etapas consistentes en: (i) cultivar una célula hospedadora transformante según la reivindicación 10 u 11 en condiciones adecuadas para permitir la expresión de dicho anticuerpo y (ii) recuperar el anticuerpo expresado.

13. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un fragmento del mismo según la reivindicación 7, o un ácido nucleico según la reivindicación 8 y/o un vector según la reivindicación 9 y/o una célula hospedadora según la reivindicación 10 u 11, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un fragmento del mismo según la reivindicación 7, conjugado con un agente anticanceroso.

15. El inmunoconjugado según la reivindicación 14, en el que dicho agente anticanceroso es un agente citotóxico o un agente inhibidor del crecimiento.

16. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un fragmento del mismo según la reivindicación 7, que está marcado con una molécula o sustancia detectable.

17. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el fragmento del mismo según la reivindicación 7, o el inmunoconjugado según la reivindicación 14 o 15, para uso para tratar un cáncer de ovario.

18. Uso in vitro de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o de un fragmento del mismo según la reivindicación 7, para el diagnóstico y/o control de un cáncer de ovario.