Composiciones y procedimientos para modular el corte y empalme de SMN2.

Un oligonucleótido antisentido dirigido al intrón 7 de una molécula de ácido nucleico que codifica SMN2,

en el que dicho oligonucleótido tiene una longitud de hasta 20 nucleótidos y comprende una modificación 2'-O-metoxietilazúcar en cada posición, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho oligonucleótido comprende la SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87 o SEC ID Nº: 89.

detallada

La tecnología antisentido es un medio eficaz para modular la expresión de uno o más productos génicos específicos, y es única en su utilidad en una serie de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. En el presente documento se proporcionan compuestos antlsentldo útiles para modular la expresión génica mediante mecanismos de acción antisentido, incluidos mecanismos antlsentldo basados en la ocupación de la diana. En un aspecto, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento modulan el corte y empalme de un gen diana. Dicha modulación incluye estimula o inhibir la Inclusión del exón. También se proporciona en el presente documento compuestos antisentido dirigidos a elementos reguladores de corte y empalme en cls presentes en moléculas de pre-ARNm, incluidos potenciadores de corte y empalme exónico, silenciadores de corte y empalme exónico, potenciadores de corte y empalme intrónico y silenciadores de corte y empalme Intrónico. Se piensa que la alteración de los elementos reguladores de corte y empalme en cis altera la selección de corte y empalme, que puede conducir a una alteración en la composición de los productos de corte y empalme.

El procesamiento de los pre-ARNm eucarióticos es un proceso complejo que requiere una multitud de señales y factores proteicos para conseguir un corte y empalme adecuado del ARNm. La definición de exón por el espliceosoma requiere más que las señales de corte y empalme canónicas que definen los límites intrón-exón. Una de estas señales adicionales se proporciona mediante secuencias silenciadoras y potenciadoras reguladoras de acción en cis. Se han identificado potenciadores de corte y empalme exónico (ESE), silenciadores de corte y empalme exónico (ESS), potenciadores de corte y empalme intrónico (ISE) y silenciadores de corte y empalme intrónico (ISS), que reprimen o potencial el uso de sitios donantes de corte y empalme o de sitios aceptores de corte y empalme en función de su sitio y su modo de acción (Yeo y col. 2004, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101 (44): 15700- 15705). La unión de proteínas específicas (factores trans) a estas secuencias reguladoras dirige el proceso de corte y empalme, bien estimulando o inhibiendo el uso de sitios de corte y empalme concretos y, por tanto, modulando la proporción de los productos de corte y empalme (Scamborova y col., 2004, Mol. Cell. Biol. 24(5): 1855-1869; Hovhannisyan y Carstens, 2005, Mol. Cell. Biol. 25(1):250-263; Minovitsky y col., 2005, Nucleic Acids Res. 33(2):714-724). Poco se sabe sobre los factores trans que interaccionan con los elementos de corte y empalme intrónico; no obstante, en varios estudios se ha proporcionado información sobre los elementos de corte y empalme exónico. Por ejemplo, se sabe que los ESE están implicados en el corte y empalme tanto alternativo como constitutivo actuando como sitios de unión para miembros de la familia de proteínas SR. Las proteínas SR se unen a elementos de corte y empalme mediante su dominio de unión a ARN y estimulan el corte y empalme reclutando los componentes del espliceosoma con interacciones proteína-proteína mediadas por su dominio RS, que está compuesto por varios dipéptidos de Arg-Ser (Cartegni y Krainer, 2003, Nat. Struct. Biol. 10(2): 120-125; Wang y col., 2005, Nucleic Acids Res. 33(16):5053-5062). Se ha descubierto que los ESE están enriquecidos en regiones de exones que están cercanas a los sitios de corte y empalme, en particular de 80 a 120 bases desde los extremos de los sitios aceptores de corte y empalme (Wu y col., 2005, Genomics 86:329-336). Se han determinado secuencias consenso para cuatro miembros de la familia de proteínas SR, SF2/ASF, SC35, SRp40 y SRp55 (Cartegni y col., 2003, Nucleic Acids Res. 31(13):3568-3571).

Aunque los factores trans que se unen a los elementos reguladores de corte y empalme intrónico no se han estudiado extensamente, se ha sugerido que tanto las proteínas SR como las ribonucleoproteínas heterogéneas (hnRNP) interaccionan con estos elementos (Yeo y col., 2004, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101 (44):15700-15705). Se han identificado dos elementos potenciadores de corte y empalme intrónico (ISE) en SMN2, uno en el intrón 6 y el otro en el intrón 7 (Miyajima y col., 2002, J. Biol. Chem. 22: 23271-23277). Ensayos de desplazamiento de gel usado el ISE en el intrón 7 han mostrado la formación de complejos ARN-proteína, que sugieren que estas proteínas trans pueden ser importantes para la regulación del corte y empalme (Miyaso y col. 2003, J. Biol. Chem. 278(18): 15825-15831).

El papel de la SMN2 en enfermedades tales como la atrofia muscular espinal (SMA) la convierte en una importante diana terapéutica. La SMA es un trastorno genético caracterizado por la degeneración de neuronas motoras espinales. La SMA se debe a la pérdida de ambas copias funcionales de SMN1. No obstante, la SMN2 tiene el potencial de codificar la misma proteína que SMN1 y, por tanto, superar el efecto genético de los pacientes de SMA. La SMN2 contiene una mutación traduccionalmente silente (C->T) en la posición +6 del exón 7 (nucleótido 66 de la SEC ID N° 1), que tiene como resultado una inclusión ineficiente del exón 1 en los transcritos de SMN2. Por

tanto, la forma predominante de SMN2, una que carece del exón 7, es inestable e inactiva. Por tanto, los compuestos terapéuticos capaces de modular el corte y empalme de SMN2 de forma que el porcentaje de los transcritos de SMN2 que contiene el exón 7 aumenta, sería útil para el tratamiento de la SMA.

Visión general

En el presente documento se divulgan compuestos oligoméricos, incluidos oligonucleótidos antisentido y otros compuestos antisentido para usar en la modulación de la expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican SMN2. Esto se consigue proporcionando compuestos oligoméricos que hibridan con una o más moléculas de ácido nucleico diana que codifican SMN2. Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico diana" y "molécula de ácido nucleico que codifica SMN2" ese han usado por comodidad para abarcar ADN que codifica SMN2, ARN (incluyendo pre-ARNm y ARNm o partes de los mismos) transcritos a partir de tal ADN, y también el ADNc derivado de tal ARN.

En el presente documento se divulgan compuestos antisentido para uso en la modulación del corte y empalme de de pre-ARNm de SMN2. En una realización, los compuestos antisentido divulgados están dirigidos al exón 7 de SMN2 de modo que se modula el corte y empalme del ARNm de SMN. En otra realización, los compuestos antisentido están dirigidos al ¡ntrón 6 de SMN2. En otra realización, los compuestos antisentido están dirigidos al ¡ntrón 7 de SMN2. La modulación del corte y empalme puede tener como resultado la inclusión del exón 7 o el sorteo del exón 7.

También se divulgan compuestos antisentido dirigidos a los elementos reguladores en cis. En una realización, el elemento regulador está en un exón. En una realización, el elemento regulador está en un intrón.

Modulación del corte y empalme

Como se usa en el presente documento, la modulación del corte y empalme se refiere a alterar el procesamiento de un transcrito de pre-ARNm de modo que la molécula de ARNm sometida a corte y empalme contiene una combinación diferente de exones como resultado del sorteo del exón o de la inclusión del exón, una deleclón en uno o más exones, o una secuencia adicional que normalmente no se encuentra en el ARNm sometido a corte y empalme (p. ej., secuencia intrónica). En el contexto de la presente invención, la modulación de corte y empalme se refiere a alterar el corte y empalme del pre-ARNm de SMN2 para conseguir el sorteo del exón o la inclusión del exón. En una realización, el sorteo del exón tiene como resultado un tránscrito de ARNm de SMN2 que carece del exón 7 y la inclusión del exón tiene como resultado un tránscrito de ARNm de SMN2 que contiene el exón 7.

Como se usa en el presente documento, un corte y empalme alternativo se define como el corte y empalme junto con diferentes combinaciones de exones, que pueden tener como resultado múltiples tránscritos de ARNm de un único gen. En el contexto de la presente invención, un tránscrito de de ARNm de SMN2 que contiene el exón 7 y un tránscrito de de ARNm de SMN2 que carece del exón 7 son dos productos del corte y empalme alternativo.

Compuestos

La expresión "compuesto oligomérico" se refiere a una estructura polimérica capaz de hibridar con una región de una molécula de ácido nucleico. Esta expresión incluye oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos y combinaciones quiméricas de estos. Un "compuesto antisentido" o "compuesto oligomérico antisentido" se... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido dirigido al ¡ntrón 7 de una molécula de ácido nucleico que codifica SMN2, en el que dicho oligonucleótido tiene una longitud de hasta 20 nucleótidos y comprende una modificación 2-0-metox¡et¡lazúcar en cada posición, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho oligonucleótido comprende la SEC ID N°: 83, SEC ID N°: 85, SEC ID N°: 87 o SEC ID N°: 89.

2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende al menos una 5-metilcitosina, y opcionalmente todos los residuos de cltoslna son 5-metilcitosinas.

3. El oligonucleótido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el oligonucleótido es una sal farmacéuticamente aceptable, y opclonalmente una sal de sodio

4. El oligonucleótido de cualquier reivindicación anterior, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho oligonucleótido:

(a) comprende no más del 5% de discrepancias de emparejamiento de bases en relación con la SEC ID N° 1; o

(b) no contiene discrepancias de emparejamiento de bases en relación a la SEC ID N° 1.

5. El oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que tiene 15 nucleótidos de longitud.

6. El oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que tiene 18 nucleótidos de longitud.

7. El oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que tiene 20 nucleótidos de longitud.

8. El oligonucleótido de cualquier reivindicación anterior, que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, y opcionalmente comprende al menos un enlace fosforotioato.

9. Un procedimiento de promover la inclusión de exón 7 en los transcritos de SMN2 en una célula, tejido u órgano, que comprende poner en contacto dicha célula, tejido u órgano in vitro con el oligonucleótido antlsentldo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Un oligonucleótido antisentldo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en terapia, y opcionalmente para su uso en el tratamiento de atrofia muscular espinal.

11. El uso de un oligonucleótido antlsentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de atrofia muscular espinal.

12. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antlsentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.