DERIVADOS DE LA ENZIMA INDUCTORA DE NF-KAPPAB, SU PREPARACIÓN Y SU USO.

Derivados de la enzima inductora de NF-KAPPAB, su preparación y su uso Campo de la invención La invención se refiere al uso de NIK y moléculas relacionadas para la modulación de las actividades de señalización controladas por citoquinas, y algunas de tales moléculas nuevas. Antecedentes de la invención El factor nuclear B (NF-B) es una familia de complejos del factor de transcripción eucariótico inducible que participan en la regulación de la respuesta inmunitaria, el crecimiento celular, y la supervivencia [Ghosh et al. 1998]. Los factores NF-B son secuestrados normalmente en el compartimento citoplásmico por asociación física con una familia de inhibidores ricos en anquirina citoplásmica denominados IB, incluyendo IB y proteínas relacionadas [Baldwin et al. 1996]. En respuesta a diversos estímulos, incluyendo las citoquinas, los mitógenos, y ciertos productos génicos virales, el IB es rápidamente fosforilado en las serinas 32 y 36, ubiquitinado y después degradado por el proteosoma 26S, que permite translocar al núcleo el NF-B liberado y participar en la transactivación del gen diana [Mercurio et al 1999, Pahl et al 1999]. Recientes estudios de clonación molecular han identificado una quinasa de IB de múltiples subunidades que media la fosforilación inducida por la señal de IB. La IKK se compone de dos subunidades catalíticas, IKK e IKKß, y una subunidad reguladora IKK. La actividad catalítica tanto de IKK como de IKKß puede ser activada por una multitud de inductores de NF-B diferentes, incluyendo las citoquinas inflamatorias, el factor de necrosis tumoral y la interleuquina-1, el receptor de células T y la proteína co-estimuladora de las células T, CD28 [Karin et al 2000]. La quinasa inductora de NF-B, NIK, (MAP3K14) es una proteína quinasa activada por mitógeno (MAP3K) que fue descubierta por los autores de la presente solicitud en 1996 (documento W0 9737016) mientras escrutaban en busca de proteínas que se unían a la proteína adaptadora asociada al receptor TNF TRAF2 [Rothe et al. 1994, Takeuchi et al. 1996]. La activación marcada de NF-B tras la expresión en exceso de esta proteína quinasa, y la inhibición eficaz de la activación de NF-B en respuesta a una variedad de agentes inductores (LMP1, TNFR1, TNFR2, RANK, hTollR, CD3/CD28, interleuquina-lR, Tax de virus linfotrópico de células T humanas-1, LPS y otros [Mlinin et al. 1997, Sylla et al 1998, Darnay et al. 1999, Lin et al. 1999, Geleziunas et al. 1998] tras la expresión de mutantes NIK catalíticamente inactivos sugirieron que NIK participa en la señalización para la activación de NF-B [Mlinin et al. 1997]. La desorganización dirigida del gen NIK [Yin et al 2001] y el estudio de una cepa de ratón de origen natural con una mutación puntual de sentido erróneo en NIK (glicina a arginina en el codón 855 de mNIK) [Shinkaura et al. 1999] revelaron un papel esencial de NIK en el desarrollo de órganos linfoides, de este modo la cepa mutante de ratones se ha denominado ratones "con alinfoplasia (aly)". Los ratones tanto alylaly como con el gen NIK desactivado manifiestan una ausencia generalizada de ganglios linfáticos y de placas de Peyer, arquitecturas esplénicas y tímicas desorganizadas, e inmunodeficiencia cuyos rasgos más resilientes son niveles bajos de Ig en suero y carencia de rechazo a injertos [Shinkaura et al. 1999]. Estas anomalías reflejan aparentemente una señalización aberrante por una variedad de receptores. Las deficiencias evolutivas de los ratones mutantes para NIK se asemejan a aquellas encontradas en ratones carentes del receptor de LTß (LTßR) sugiriendo que NIK participa en la señalización por este receptor concreto. Se pudo demostrar que el deterioro de la capacidad proliferativa de las células B en los ratones alylaly se corresponde con una respuesta deficiente de estas células a LPS y CD40L [Garceau et al. 2000], y la presencia de cantidades excesivas de células B1 en la cavidad peritoneal de los ratones pudo ser adscrita a defectos en el alojamiento de células peritoneales en el sistema tisular linfático asociado al intestino como consecuencia de una señalización deficiente de receptor de quimioquina en el tejido linfoide secundario [Fagarasan et al. 2000]. Aparte de estas y probablemente otras contribuciones a la regulación del desarrollo y la función del sistema inmunitario, también parece que NIK está implicado en la regulación de diferentes funciones no inmunitarias. Los ratones alylaly (aunque no los que tienen el gen NIK desactivado) muestran un desarrollo deficiente de la glándula mamaria [Miyawaki 1994]. Por otra parte, estudios in vitro implicaron a NIK en la señalización que conduce a la diferenciación de las células de la musculatura esquelética [Canicio et al. 2001] y en la supervivencia y diferenciación de las neuronas [Foher et al 2000]. Coincidiendo con el papel sugerido de NIK como mediador de la activación de NF-B, los fibroblastos derivados de ratones alylaly y NIK-/- no lograban activar NF-B en respuesta a la activación de LTßR. Por otra parte, la regulación al alza por LTßR de VCAM-1, que se produce por medio de la activación de NF-B, es anómala en fibroblastos embrionarios murinos alylaly [Matsumoto et al. 1999]. También se ha observado una fosforilación deficiente de IB en respuesta a linfocitos B alylaly para la ligación a CD40. En contraste, en células dendríticas de estos ratones la fosforilación de IB inducida por CD40 parecía normal [Garceau et al 1998]. Las células peritoneales alylaly también son incapaces de responder a la quimioquina SLC con un incremento de la actividad de NF-B [Fagarasan et al. 2000]. Sin embargo, en ninguna de las células examinadas hasta ahora se encontró que el efecto de TNF o IL-1 sobre la activación de NF-B fuera anulado por la mutación de NIK. 2   La evaluación del patrón de las especies de NF-B en órganos linfoides de ratones alylaly indicó que, aparte de su papel en la regulación de los complejos de NF-B compuesto de las proteínas Rel (A+p50) e IKB, NIK también participa en el control de la expresión/activación de otras especies de NF-B. Muy notablemente, los linfocitos de los ratones alylaly fueron deficientes en p52, una especie de NF-B que se forma específicamente en linfocitos B maduros a través del procesamiento proteolítico de un precursor inactivo, p100 (NF-B2), sugiriendo una deficiencia en la conversión p100-p52 [Yamada et al. 2000]. En efecto, se ha demostrado que NIK participa en la fosforilación específica del sitio de p100. Ambos terminan directamente a través de la fosforilación de IKK, que a su vez fosforila p100. Esta fosforilación sirve como disparador molecular para la ubiquitinación y el procesamiento activo de p100 para formar p52. Se encontró que esta actividad de procesamiento de p100 era anulada por la mutación aly [Xiao et al. 2001, Senftleben et al. 2001]. A la vista de la homología estructural de NIK con las MAP3K, se han realizado algunos intentos para explorar la implicación de NIK en las otras tres principales cascadas de proteína quinasa que se sabe que implican a las MAP3K (las cascadas de MAP quinasa: cascadas ERK, JNK y p38) [Akiba et al. 1998]. Aunque en ciertas células NIK parece no participar en ninguna de estas cascadas, algunas otras células (PC12) parecen implicar a NIK en la cascada ERK [Fochr et al. 2000]. Asimismo se ha presentado la evidencia de que en ciertas células NIK puede participar en la señalización para la fosforilación de Jun, la diana aguas abajo de la cascada JNK, de un modo que es independiente de esta cascada concreta [Akiba et al. 1998, Natoli et al. 1997]. En conjunto, estos descubrimientos indican que NIK sirve en efecto como mediador de la activación de NF-B, pero también puede servir para otras funciones, y que ejerce estas funciones de una manera específica de la célula y del receptor. Como otras MAP3K, NIK puede ser activada como consecuencia de la fosforilación del "bucle de activación" dentro de la molécula de NIK. En efecto, la mutación de un sitio de fosforilación dentro de este bucle (Thr-559) evita la activación de NF-B tras la expresión en exceso de NIK [Lin et al. 1999]. Además, la actividad de NIK parece estar regulada a través de la capacidad de las regiones aguas arriba y aguas abajo de este motivo quinasa para unirse entre sí. Se ha demostrado que la región C-terminal de NIK aguas abajo de su radical quinasa es capaz de unirse directamente a IKK [Regnier et al. 1997] así como a p100 [Xiao et al. 2001] y a TRAF2 [Malinin et al. 1997], estas interacciones se requieren aparentemente para la función de NIK en la señalización de NF-B. La región N-terminal de NIK contiene un dominio regulador negativo (NRD), que está compuesto por un motivo alcalino (BR) y un motivo de repetición rico en prolina (PRR) [Xiao et al. 2000]. Aparentemente, el NRD N-terminal interacciona... [Seguir leyendo]

1. El fragmento polipeptídico de la quinasa inductora de NF-B (NIK) que consiste en el extremo C de NIK desde el residuo 624 al residuo 947 como se muestra en el SEQ ID NO: 19, o una muteína del mismo en el que hasta 25% de los residuos de aminoácido son suprimidos, añadidos o sustituidos por otros residuos de aminoácido o un derivado permutado circularmente del mismo, o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento polipeptídico de NIK, muteína, derivado permutado circularmente o fragmento del mismo es capaz de unirse a la cadena gamma común (cc) de IL-2R. 2. El fragmento polipeptídico de NIK de la reivindicación 1, que comprende NIK640 a 720 (SEQ ID NO: 18). 3. Una muteína del fragmento polipeptídico de NIK de la reivindicación 1, donde el codón correspondiente al codón 860 de NIK humana codifica arginina en lugar de glicina. 4. Un ADN que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 o 2. 5. Un vector que comprende el ADN de la reivindicación 4. 6. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 5. 7. Un método para la producción del polipéptido de la reivindicación 1 o 2, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 6 y recoger el polipéptido producido. 8. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce y se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 1 o 2 y es capaz de inhibir la interacción NIK-cc. 9. El anticuerpo de la reivindicación 8, que es policlonal o monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo totalmente humanizado, un anticuerpo anti-Id o un anticuerpo intracelular. 10. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento polipeptídico de NIK, o una muteína, un derivado permutado circularmente o un fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ADN de la reivindicación 4 o el ADN antisentido de este, el vector de la reivindicación 5 o un vector que comprende dicho ADN antisentido, o el anticuerpo de la reivindicación 8 o 9. 11. Una composición farmacéutica que comprende NIK, o un fragmento polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ADN de la reivindicación 4 o el ADN antisentido de este, el vector de la reivindicación 5 o un vector que comprende dicho ADN antisentido, o el anticuerpo de la reivindicación 8 o 9 para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, la artritis reumatoide y otras artropatías, la osteoartritis, la enfermedad inflamatoria intestinal, el asma, el infarto cardíaco, la enfermedad de Alzheimer o la aterosclerosis, la tiroiditis inmunitaria y la anemia hemolítica autoinmunitaria. 12. El uso de NIK, un fragmento polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ADN de la reivindicación 4 o el ADN antisentido de este, el vector de la reivindicación 5 o un vector que comprende dicho ADN antisentido, o el anticuerpo de la reivindicación 8 o 9 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer, la artritis reumatoide y otras artropatías, la osteoartritis, la enfermedad inflamatoria intestinal, el asma, el infarto cardíaco, la enfermedad de Alzheimer o la aterosclerosis, la tiroiditis inmunitaria y la anemia hemolítica autoinmunitaria. 39     41   42   43   44     46   47   48   49