Utilización de células procedentes del tejido adiposo para inducir a la formación de una red vascular funcional.

Uso de células del tejido adiposo blanco, medular o extra-medular que forman subpoblaciones homogéneas,

CD13+, HLA ABC+, CD14-, CD45-, CD31-, CD 144- y CD34+, para la preparación de un medicamento destinado a la reconstrucción total o parcial de una red vascular funcional.

Utilización de células procedentes del tejido adiposo para inducir a la formación de una red vascular funcional La presente invención se refiere al uso de células procedentes del tejido adiposo blanco medular o extramedular y, en particular, de la fracción estromal vascular extra-medular (FSV) , y/o de adipocitos maduros desdiferenciados sea cual sea su origen, para inducir a la formación de una vascularización funcional.

Existe una necesidad, en particular en las sociedades occidentales, de medios terapéuticos eficaces que estimulan la neovascularización, para limitar las complicaciones asociadas a las patologías isquémicas y/o favorecer la regeneración de los tejidos.

Hasta ahora, las estrategias terapéuticas propuestas para limitar los efectos nocivos de la isquemia recurren a la estimulación del crecimiento y de la remodelación de los vasos en el mismo sitio de la isquemia y/o al trasplante de células progenitoras endoteliales. Para la obtención de células endoteliales aptas para permitir efectivamente una revascularización de un sector isquémico, los métodos propuestos hasta ahora se basan esencialmente en la obtención de células endoteliales maduras a partir de células progenitoras endoteliales circulantes del adulto. Estas células mononucleadas humanas de origen hematopoyético, procedentes de la línea monocitos/macrófagos (CD45+, CD14+) son aisladas a partir de la médula ósea (BM-MNC por bone marrow-mononuclear cells) o de la sangre periférica, en presencia de factores de crecimiento angiogénicos (20; 21; 27; 38; 39) .

Más particularmente, se ha demostrado que el trasplante de BM-MNC (bone marrow-mononuclear cells) estimulaba efectivamente la neovascularización en las isquemias experimentales y conllevaba una mejora significativa y una supervivencia a largo plazo de los tejidos lesionados (26; 27) . Los ensayos efectuados en el ser humano muestran el potencial de tal terapia para limitar la progresión de la enfermedad (28-32) .

Sin embargo, el bajo porcentaje y la dificultad de expansión ex vivo de estas células progenitoras endoteliales y el deterioro funcional de estas células, observado en condiciones patológicas, constituyen una limitación mayor para su uso en el tratamiento de la isquemia.

Como consecuencia, existe por lo tanto una necesidad real de disponer de una fuente de células que forman una población celular homogénea, capaz de diferenciarse en células endoteliales maduras, utilizables en particular en el ámbito de la reparación de tejidos dañados por isquemia, que sea sencilla de obtener y eficaz.

El tejido adiposo existe en diferentes formas en los mamíferos: el tejido adiposo blanco extramedular que representa el principal órgano de reserva del organismo, el tejido adiposo blanco medular cuyo papel exacto no se conoce y el tejido adiposo pardo termogénico.

Debido a su importante potencial de expansión que persiste a lo largo de la vida del individuo, el tejido adiposo blanco del adulto constituye una fuente de células abundantes y fáciles de obtener.

Este tejido adiposo blanco está constituido por dos fracciones celulares:

- una fracción adipocitaria que representa del 30% a 60% de las células del tejido adiposo, y está caracterizada

por la acumulación de triglicéridos (fracción de células flotantes) . Esta fracción está compuesta en su gran mayoría (99%) de adipocitos diferenciados y de algunos macrófagos contaminantes, ricos en gotitas lipídicas, y -una fracción no adipocitaria, denominada fracción del estroma vascular (FSV) , que comprende algunas células sanguíneas, algunas células endoteliales maduras (células del endotelio microvascular: CD31+, CD144+) , unos pericitos, unos fibroblastos y unas células madre pluripotentes.

Se ha demostrado que la fracción estromal vascular, habitualmente utilizada para estudiar la diferenciación de los preadipocitos en adipocitos maduros, era una fuente de células madre pluripotentes que comprenden, además, unos progenitores adipocitarios (preadipocitos) , únicamente unos progenitores hematopoyéticos y neurogénicos, así como unas células madre mesenquimatosas, capaces de diferenciarse en líneas osteogénicas, condrogénicas y miogénicas (10; 11; 12; 13; Solicitud internacional PCT WO 02/055678 y solicitud americana US 2003/0082152) .

Estas dos fracciones celulares pueden ser separadas por su diferencia de densidad, según procedimientos tales como los descritos por BjÃrntorp y otros (14) .

El tejido adiposo blanco posee propiedades angiogénicas únicas que resultan del efecto sobre las células endoteliales vasculares diferenciadas, de factores pro-angiogénicos producidos por los adipocitos (Bouloumié y otros, Ann. Endocrin., 2002, 63, 91-95; Wang y otros, Horm. Metab. Res., 2003, 35, 211-216) y las células de la fracción estromal vascular (Rehman y otros, Journal of the American College of Cardiology, 2003, 41, 6 suplemento A, 308A) . Estas propiedades angiogénicas, que desempeñan aparentemente un papel en la actividad metabólica y en la expansión del tejido adiposo, tienen unas aplicaciones en terapia celular autóloga, para favorecer la angiogénesis en un contexto post-traumático o patológico (post-isquémico) . Así, la inyección de tejido adiposo autólogo se practica habitualmente en cirugía, para favorecer la revascularización de los injertos y la reconstrucción de los tejidos blandos (Bouloumié y otros; Wang y otros, antes citados) . Además, se preconizó, asimismo, administrar la fracción estromal vascular autóloga para favorecer la angiogénesis, en el tratamiento de la enfermedad coronaria (Rehman y otros, antes citado) .

Sin embargo, la neovascularización no sólo resulta del efecto de factores pro-angiogénicos sobre las células endoteliales de los vasos preexistentes (angiogénesis) , sino también de la producción y de la incorporación, en los vasos en formación, de células endoteliales diferenciadas, producidas a partir de células progenitoras endoteliales (vasculogénesis) .

Tales células progenitoras endoteliales no se aislaron a partir del tejido adiposo y en particular de la fracción estromal vascular que contiene unas células pluripotentes.

En este contexto, los inventores han aislado una subpoblación homogénea de células de tejido adiposo blanco medular o extra-medular (fáciles de obtener (liposucción, por ejemplo) , capaz de diferenciarse en células endoteliales maduras que permiten obtener una reconstrucción total o parcial de una red vascular funcional.

La presente invención tiene, por consiguiente, como objeto el uso de células del tejido adiposo blanco medular o extra-medular que forma subpoblaciones homogéneas, que expresan, al menos, los antígenos de superficie CD13 y HLA ABC y CD34 (CD13+, HLA ABC+, CD34+) y que no expresan los antígenos de superficie CD14, CD45, CD31 y CD144, para la preparación de un medicamento destinado a la reconstrucción total o parcial de una red vascular funcional, en particular en el contexto de una isquemia.

Según un segundo modo de realización ventajoso de dicha utilización, dichas células del tejido adiposo están representadas por una subpoblación homogénea de células de la fracción estromal vascular extra-medular (denominadas a continuación FSV-CULT) , susceptibles de ser obtenidas mediante expansión celular limitada en un cultivo.

Según una disposición ventajosa de este modo de realización, dicha subpoblación homogénea de células de fracción estromal vascular extra-medular es susceptible de ser obtenida mediante una expansión celular limitada por un número de pasos sucesivos inferior a 10 de dichas células.

Así, de manera sorprendente, una expansión celular limitada, debido al número de pasos sucesivos limitados a 10 como máximo, favorece la proliferación de una población homogénea de células que poseen unos antígenos de superficie que son característicos de las células de potencial pro-angiogénico, pero que no poseen ningún marcador de superficie característico de las células hematopoyéticas que incluyen las de la línea de monocitos/macrófagos o de células endoteliales diferenciadas.

Asimismo, de manera sorprendente, se obtienen tales células por cultivo en medio mínimo, tal como un medio DMEM que comprende 10% de suero de ternero fetal o de neonato, por ejemplo.

Unas condiciones particulares, que inducen más rápidamente unas características pro-angiogénicas, pueden asimismo ser aplicadas. Se especifican... [Seguir leyendo]

1. Uso de células del tejido adiposo blanco, medular o extra-medular que forman subpoblaciones homogéneas, CD13+, HLA ABC+, CD14-, CD45-, CD31-, C.

14. y CD34+, para la preparación de un medicamento destinado a la reconstrucción total o parcial de una red vascular funcional.

2. Uso, según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células del tejido adiposo están representadas por una subpoblación homogénea de células de la fracción estromal vascular extra-medular, susceptibles de ser obtenidas mediante expansión celular limitada en cultivo.

3. Uso, según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha subpoblación homogénea de células de la fracción estromal vascular extra-medular es susceptible de ser obtenida mediante expansión celular, limitada por un número de pasos sucesivos inferior a 10 de dichas células.

4. Uso, según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células del tejido adiposo están representadas por una subpoblación homogénea de adipocitos maduros desdiferenciados.

5. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dichas células del tejido adiposo que forman subpoblaciones homogéneas, que expresan al menos los antígenos de superficie CD13 y HLA ABC, están asociadas a un soporte polimérico sólido o semi-sólido.

6. Uso, según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho soporte polimérico sólido se selecciona del grupo constituido por las matrices membranarias básicas reconstituidas que comprenden al menos uno de los elementos siguientes: colágeno, laminina y proteoglicanos, y las matrices extracelulares reconstituidas que comprenden uno de los elementos siguientes: fibronectina, colágeno, laminina y trombospondina.

7. Uso, según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizado porque dicho soporte polimérico puede comprender, además, unas enzimas de degradación de dichas matrices, así como inhibidores enzimáticos y factores de crecimiento.

8. Uso, según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho soporte polimérico semi-sólido es preferentemente un derivado celulósico y en particular metilcelulosa.

9. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dichas células son genéticamente modificadas.

10. Uso, según la reivindicación 9, caracterizado porque dichas células comprenden, al menos, una mutación de un gen autólogo.

11. Uso, según la reivindicación 9, caracterizado porque dichas células contienen, al menos, una copia de un gen heterólogo.

12. Uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque dichas células son de origen humano.

13. Uso de una composición que contiene células del tejido adiposo blanco, medular o extra-medular que forman subpoblaciones homogéneas, que expresan al menos los antígenos de superficie CD13 y HLA ABC, tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y al menos un vehículo y/o un soporte apropiado para una administración parenteral o en el sitio, para la preparación de un medicamento destinado a la reconstrucción total o parcial de una red vascular funcional.

14. Composición farmacéutica que contiene células del tejido adiposo blanco, medular o extra-medular que forman subpoblaciones homogéneas, que expresan al menos los antígenos de superficie CD13 y HLA ABC y que no expresan los antígenos de superficie CD14, CD45, CD31 y CD144, tales como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 9 a 12, estando dichas células asociadas a un soporte polimérico sólido o semi-sólido, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, y al menos un vehículo y/o un soporte apropiado para una administración parenteral o en el sitio.

15. Procedimiento de cultivo de células del tejido adiposo blanco medular o extra-medular que forman subpoblaciones homogéneas, que expresan al menos los antígenos de superficie CD13 y HLA ABC, caracterizándose dicho procedimiento porque comprende, al menos, las etapas siguientes:

- expansión celular limitada de células de la fracción estromal vascular extra-medular o de adipocitos maduros desdiferenciados, por un número de pasos sucesivos inferiores a 10 de dichas células sobre un soporte de cultivo sólido adecuado, en un medio que comprende al menos un factor de crecimiento apto para estimular la formación de células endoteliales y eventualmente, al menos, una citoquina adecuada;

- modificación, de manera continua o transitoria, del entorno en oxígeno del cultivo, y

- modificación, de manera continua o transitoria, del equilibrio redox de dichas células o de la producción de especies activas del oxígeno por dichas células, mediante la adición de moléculas pro- o antioxidantes en el medio extra o intracelular.

16. Procedimiento, según la reivindicación 15, caracterizado porque el factor de crecimiento apto para estimular la formación de células endoteliales es en particular VEGF, preferentemente a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml.

17. Procedimiento, según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, caracterizado porque el entorno de oxígeno del cultivo está al 1%; desde algunas horas hasta algunos días.

18. Procedimiento de cribado de moléculas activas sobre las células endoteliales diferenciadas, caracterizándose dicho procedimiento porque comprende al menos las etapas siguientes: 15

- cultivar las células del tejido adiposo blanco medular o extra-medular que forman subpoblaciones homogéneas, que expresan al menos los antígenos de superficie CD13 y HLA ABC y que no expresan los antígenos de superficie CD14, CD45, CD31 y CD144, tal como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 9 a 12, en un medio de cultivo polimérico semi-sólido,

-poner en contacto unas células endoteliales diferenciadas así obtenidas con un banco de moléculas a testar, -identificar y seleccionar unas moléculas activas sobre dichas células endoteliales diferenciadas.