Reactivo a base de tromboplastina estable a largo plazo.

Reactivo que contiene un factor tisular y fosfolípidos, caracterizado porque contiene al menos un polifenol solubleen agua que presenta al menos una función catecol,

en una concentración de 0,15 a 10 mM, de formaespecialmente preferente de 0,5 a 2 mM.

Reactivo a base de tromboplastina estable a largo plazo La presente invención corresponde al área de diagnóstico de coagulación y hace referencia a un reactivo en base al factor tisular recombinante o nativo y a fosfolípidos, el cual puede ser estabilizado a través de la adición de un polifenol.

El factor tisular (tromboplastina, “tissue factor” en inglés) es una proteína transmembranal de gran importancia para la coagulación de la sangre. Se expresa por células que por lo general no se encuentran en contacto con sangre circulante, como por ejemplo células en el subendotelio (musculatura lisa) y células que rodean los vasos sanguíneos (por ejemplo fibroblastos) . No obstante, en el caso de un daño en el vaso sanguíneo, las células que expresan el factor tisular, entran en contacto con el factor VII, un factor precoagulatorio para la coagulación de la sangre que circula en la sangre. En presencia de calcio, el factor tisular y el factor VII forman un complejo, y la actividad del factor VII aumenta mil veces (F VII > F Vlla) . El complejo del factor tisular y el factor Vlla, en presencia de fosfolípidos, cataliza la conversión del factor de coagulación inactivo, el factor X, en un factor Xa activado, acelerando así el proceso de coagulación. Junto con el factor VII, el factor tisular forma la así llamada vía extrínseca de la coagulación de la sangre, a través de la cual debe impedirse una lesión de los vasos sanguíneos mediante una coagulación de la sangre lo más rápida posible.

En el diagnóstico de coagulación fueron desarrollados diferentes procedimientos in vitro mediante cuya ayuda puede determinarse si la sangre o el plasma de un paciente puede coagular de forma correcta, o si existe alguna coagulopatía. En el caso de una coagulopatía, con frecuencia es necesario obtener información más precisa sobre la causa de la afección existente para poder escoger las medidas terapéuticas óptimas. El factor tisular se utiliza para examinar diferentes subfunciones de la coagulación de la sangre, en particular para examinar el sistema extrínseco de la coagulación de la sangre. La aplicación más conocida del factor tisular como activador de coagulación es la así llamada prueba rápida (quick test, en inglés) para determinar el tiempo de protrombina (PT) (sinónimo: tiempo de tromboplastina) . En la prueba rápida y sus variantes, por lo general, una muestra de plasma se mezcla con factor tisular, fosfolípidos e iones de calcio, y se mide en segundos el tiempo desde el momento del mezclado hasta la formación de fibrina tangible. En las pruebas de coagulación donde se utilizan sustratos cromógenos, de forma alternativa, se mide el tiempo desde el momento del mezclado hasta alcanzar una variación de absorción determinada. El factor tisular se emplea también en otros procedimientos de prueba que no se utilizan para determinar el tiempo de coagulación, sino para determinar componentes individuales del sistema de coagulación, como por ejemplo el potencial de trombina endógena (ETP, por sus siglas en inglés) (EP 420 332 A2) . En principio, el factor tisular puede utilizarse en todas las pruebas vinculadas a la coagulación extrínseca.

El reactivo de tromboplastina (reactivo de factor tisular) tiene una importancia central para la respectiva prueba. Generalmente, un reactivo de tromboplastina contiene el factor tisular junto con fosfolípidos activos para la coagulación. El factor tisular se obtiene como extracto tisular de diferentes órganos (por ejemplo del cerebro, la placenta, el pulmón) de especies diferentes (por ejemplo conejos, seres humanos, bovinos) , o se produce de forma recombinante. En el estado de arte se conocen numerosos métodos para obtener factor tisular y para producir reactivos de tromboplastina, y una gran cantidad de reactivos de tromboplastina puede obtenerse a través del comercio.

En la solicitud US 4 416 812 se describe un reactivo correspondiente.

Actualmente, la mayoría de los reactivos de tromboplastina que pueden obtenerse a través del comercio son tratados de forma liofilizada y por lo tanto, antes de ser utilizados, deben ser disueltos en un medio de reconstitución, por ejemplo en agua destilada o en una solución tampón. Este proceso se realiza debido a la escasa estabilidad de los reactivos en estado líquido. La desventaja de los reactivos que se proporcionan de forma liofilizada reside no sólo en el hecho de que el fabricante y el usuario deben ejecutar pasos del procedimiento adicionales, para los cuales se invierte mucho tiempo y dinero (liofilización y reconstitución) , sino también en que estas medidas adicionales implican el riesgo de que se produzcan errores que pueden perjudicar la calidad del reactivo. Se consideran preferentes, por tanto, las fórmulas de reactivos líquidas, listas para ser utilizadas. Pero al suministrarse reactivos de tromboplastina líquidos se presenta el problema de su escasa estabilidad. Como la estabilidad del reactivo de tromboplastina, a modo de ejemplo, puede entenderse la constante temporal del tiempo de protrombina para un plasma definido, por ejemplo un plasma normal. De forma ideal, un reactivo de tromboplastina debería mantener sus especificaciones durante el tiempo de su almacenamiento o de su uso, o en el mejor de los casos tales propiedades y características como en el momento de su producción.

En el estado del arte se describen diferentes estrategias para estabilizar reactivos de tromboplastina líquidos. En la solicitud EP 942 284 A2 se describe un reactivo de tromboplastina en base a factor tisular recombinante que es estabilizado a través de la adición combinada de ácido ascórbico y una albúmina sérica. En la solicitud US 3, 522, 148 se describe un reactivo líquido de tromboplastina en base a factor tisular (natural) extraído de un tejido, el cual es estabilizado a través de la adición de determinadas sales de calcio o de sodio. En la solicitud EP 585 987 A1 se

describe otro reactivo líquido de tromboplastina en base a factor tisular natural que es estabilizado a través de la adición de diferentes estabilizadores, como albúmina o polietilenglicol, así como diferentes sustancias con actividad antimicrobiana, como azida de sodio o antibióticos.

Es objeto de la presente invención el proporcionar un método alternativo para estabilizar un reactivo de tromboplastina líquido. Este objeto se alcanzará a través del método y de los objetos descritos en las reivindicaciones, conforme a la invención. En particular, este objeto se alcanzará a través de un reactivo de tromboplastina que contiene un factor tisular y fosfolípidos, al cual se le añade al menos un polifenol soluble en agua que presenta al menos una función catecol.

Los polifenoles son compuestos aromáticos que contienen en la molécula dos o más grupos hidroxilo fenólicos (véase también Macheix, Jean-Jaques y otros: Fruit Phenolics. CRC Press, Inc., Boca Raton, USA, 1990, capítulo 1) . Los polifenoles naturales se encuentran presentes en las plantas como colorantes (antocianina) , aromatizantes y ácidos tánicos (taninos) . Actualmente se conocen más de 8000 de estas sustancias vegetales, en su mayoría bioactivas, denominadas sustancias vegetales secundarias. Sus funciones en el reino vegetal abarcan desde la protección contra comedores de plantas y el ataque ocasionado por bacterias u hongos, hasta la atracción de insectos para polinizar a través de sus colores (por ejemplo en las flores) .

Como "función catecol" debe entenderse la presencia de dos grupos orto - hidroxilo en un anillo aromático del polifenol, es decir, la presencia de, respectivamente, un grupo hidroxilo en dos átomos de carbono directamente contiguos de un anillo aromático (por ejemplo en posición 1, 2; posición 2, 3; posición 3, 4; etc., como por ejemplo en el ácido 3, 4 dihidroxibenzoico) .

Dentro del marco de la presente invención, se consideran como polifenoles adecuados aquellos que al menos presentan una función catecol. Éstos pueden presentar más de una función catecol, donde las funciones catecol pueden estar presentes tanto en el mismo anillo aromático, como también en diferentes anillos aromáticos del polifenol. Por ejemplo, dos funciones catecol pueden existir debido a que un anillo aromático de los grupos orto hidroxilos (por ejemplo en la posición 3, 4, 5; como por ejemplo galocatequina) , o dos anillos aromáticos del compuesto presentan, respectivamente, una función catecol (como por ejemplo el ácido rosmarínico) . Por ejemplo, tres funciones catecol pueden encontrarse presentes debido a que un primer anillo aromático presenta tres grupos orto - hidroxilos y un segundo anillo aromático dos grupos orto - hidroxilos (como por ejemplo el galato de catequina) , o debido a que tres... [Seguir leyendo]

1. Reactivo que contiene un factor tisular y fosfolípidos, caracterizado porque contiene al menos un polifenol soluble en agua que presenta al menos una función catecol, en una concentración de 0, 15 a 10 mM, de forma especialmente preferente de 0, 5 a 2 mM.

2. Reactivo conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque contiene dos o más polifenoles solubles en agua, de los cuales al menos uno presenta al menos una función catecol.

3. Reactivo conforme a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque contiene al menos un polifenol soluble en agua del grupo de los flavonoides, el cual presenta al menos una función catecol.

4. Reactivo conforme a la reivindicación 3, caracterizado porque contiene un flavonoide del grupo quercetina, rutina, miricetina, catequina, epicatequina, galocatequina, epigalocatequina, galato de epigalocatequina, luteolina, delfinidina, petunidina y cianidina.

5. Reactivo conforme a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque contiene al menos un polifenol soluble en agua del grupo de los ácidos fenólicos, el cual presenta al menos una función catecol.

6. Reactivo conforme a la reivindicación 5, caracterizado porque contiene un ácido fenólico del grupo del ácido gálico, ácido protocatéquico, ácido cafeico, ácido rosmarínico, ácido clorogénico y ácido caftárico.

7. Reactivo conforme a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, de forma adicional, contiene ácido L-ascórbico.

8. Reactivo conforme a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, de forma adicional, contiene polietilenglicol.

9. Reactivo conforme a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, de forma adicional, contiene al menos una sustancia que presenta actividad antimicrobiana.

10. Reactivo conforme a la reivindicación 9, caracterizado porque contiene una sustancia que presenta actividad antimicrobiana del grupo azida de sodio y timol.

11. Reactivo conforme a una de las reivindicaciones precedentes, el cual contiene factor tisular recombinante humano, factor tisular recombinante animal, factor tisular de conejo recombinante o factor tisular natural humano o animal de un extracto tisular.

12. Utilización de un reactivo conforme a una de las reivindicaciones precedentes en un procedimiento in vitro para determinar un parámetro de coagulación del grupo de tiempo de protrombina (PT) y potencial de trombina endógena (ETP) .

13. Kit de prueba para ejecutar un procedimiento in vitro para determinar un parámetro de coagulación, caracterizado porque contiene un reactivo conforme a una de las reivindicaciones 1-11.

14. Procedimiento para estabilizar un reactivo que contiene un factor tisular y fosfolípidos, caracterizado porque al reactivo se le añade al menos un polifenol soluble en agua que presenta al menos una función catecol, de manera que se encuentra contenido en el reactivo en una concentración final de 0, 15 a 10 mM, de forma especialmente preferente de 0, 5 a 2 mM.