PROCEDIMIENTO PARA PROTEGER PARTÍCULAS VIRALES.

La invención se refiere a procedimientos de proteger las partículas virales de degradación térmica y desecación. La invención también se refiere a productos que comprenden partículas virales conservadas. Antecedentes de la invención Algunas moléculas biológicas son lo suficientemente estables como para poder aislarlas, purificarlas y, después, almacenarlas en solución a temperatura ambiente. No obstante, esto no es posible para muchos materiales y se han intentado técnicas que implican almacenamiento a temperaturas bajas, adición de estabilizantes, liofilización, formación de vacío y desecación al aire para asegurar el tiempo de conservación. A pesar de la disponibilidad de estas técnicas, algunos materiales biológicos siguen mostrando niveles insatisfactorios de estabilidad durante el almacenamiento y algunas técnicas conducen a costes añadidos e incomodidad. Por ejemplo, un transporte y conservación refrigerados es costoso. Además, a menudo no se dispone de transporte refrigerado para el transporte de medicamentos, tales como vacunas en los países del mundo en vías de desarrollo. En concreto, las tensiones de la desecación por congelación o liofilización pueden ser muy dañinas para algunos materiales biológicos. La liofilización de productos farmacéuticos biológicos implica la congelación de soluciones o suspensiones de materiales biológicos termosensibles, seguido de desecación primaria y secundaria. La técnica se basa en la sublimación de agua a temperatura bajo cero al vacío sin fundir la solución. La liofilización representa una etapa clave para fabricar proteínas sólidas y productos farmacéuticos de vacuna. El índice de difusión del vapor de agua desde el material biológico congelado es muy bajo y, por tanto, el procedimiento consume tiempo. Adicionalmente, tanto las etapas de congelación como de desecación introducen tensiones que son capaces de desplegar o desnaturalizar proteínas. El documento WO-A-2006/0850082 da a conocer un producto desecado o conservado que comprende un azúcar, un material cargado tal como una proteína histona y un componente biológico de desecación o termosensible. El azúcar forma un matriz amorfo sólido. No obstante, la histona puede tener consecuencias inmunológicas si el componente biológico conservado se administra a un ser humano o animal. Resumen de la invención El presente inventor ha descubierto que las preparaciones virales mezcladas con una solución acuosa que contiene uno, dos o más azúcares y una polietilenimina (PEI) se conservan con desecación, tal como con desecación por congelación. La adición de uno o más azúcares a una preparación viral conduce a alguna conservación de infectividad viral yo inmunogenicidad. No obstante, la adición de PEI junto con uno o más azúcares conduce, sorprendentemente, a una conservación mejorada de la infectividad viral y/o la inmunogenicidad. Una mejora particularmente preferida en la infectividad y/o la inmunogenicidad se ve a concentraciones relativamente bajas de PEI y a concentraciones relativamente altas de uno o más azúcares. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para conservar las partículas virales, que comprende: (i) proporcionar a una solución acuosa uno o más azúcares, una polietilenimina y las partículas virales en las que la concentración de polietilenimina es inferior a 500 nM en base a la masa molar promedio en número (Mn) de la polietilenimina y la concentración de azúcar o, si hay más de un azúcar presente, la concentración total de azúcar es superior a 0,1M; y (ii) secar la solución para formar una matriz sólida amorfa que comprende dichas partículas virales. La invención proporciona: - un excipiente para la conservación de partículas virales, que comprende: (a) sacarosa, estaquiosa o rafinosa o cualquier combinación de las mismas; y (b) polietilenimina a una concentración basada en Mn inferior a 500nM; - uso del excipiente para la conservación de partículas virales durante y después de la desecación por congelación. - un kit que comprende el excipiente; - un procedimiento de preparar una vacuna que comprende partículas virales, en el que el procedimiento comprende: 2 E08718824 27-10-2011   (a) proporcionar a una solución acuosa uno o más azúcares, una polietilenimina y las partículas virales en las que la concentración de polietilenimina es inferior a 500 nM en base a la masa molar promedio en número (Mn) de la polietilenimina y la concentración de azúcar o, si hay más de un azúcar presente, la concentración total de azúcar es superior a 0,1M; y (b) opcionalmente añadir un adyuvante, tampón, antibiótico y/o aditivo a la mezcla; y (c) secar la solución para formar una matriz sólida amorfa que comprende dichas partículas virales; y - un polvo seco que comprende partículas virales conservadas obtenible mediante el procedimiento de la invención. Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra el efecto de un excipiente compuesto por PEI, sacarosa (Sac) y rafinosa (Raf) sobre la recuperación del virus de la enfermedad del pie-boca (FMDV-A) tras la desecación por congelación e incubación durante 24 horas a temperatura ambiente (TA) o tratamiento térmico durante 48 horas a 37 ºC (TT). Los resultados también muestran que la solución salina tamponada con fosfato (PBS) no ofrece protección durante la desecación por congelación (DC). Las barras de error representan el error estándar de la media (n= 2). La Figura 2 muestra que la PEI potencia la recuperación del FMDV-O cuando se añade a los azúcares (Sac) y estaquiosa (Estac). Los resultados obtenidos mediante el uso de un excipiente que contiene PEI, Sac y Estac se indican como Poli. Los resultados obtenidos mediante el uso de un excipiente que contiene Sac y Estac sin PEI se indican como Azúcar. El efecto se observa con FMDV-O tratado con calor durante 24 horas (24 h TT) y 6 días ("TT 6 días"). Las barras de error representan el error estándar de la media (n= 2). La Figura 3 muestra que la concentración inicial de azúcar en el excipiente es importante a la hora de mantener la estabilidad de FMDV-O. La dilución de una solución de sacarosa y estaquiosa (120 de Sac (3M):80 de Estac (0,75M)) a 1:10 en volumen produce una pérdida completa de los efectos protectoras de un excipiente con sólo azúcar. Las barras de error son el error estándar de la media (n= 3). La Figura 4.1 muestra el efecto de la proporción de sacarosa (Sac):estaquiosa (Estaq.) sobre la recuperación de FMDV-O TT desecado por congelación con diversas concentraciones de PEI. Los resultados muestran que la adición de Estac aumenta la estabilidad. Se recopilaron los resultados para cada concentración de PEI. El análisis estadístico usando un ANOVA de una vía, seguido de una prueba de Turkey mostró una mezcla que contiene toda la Saca alcanzaba una recuperación significativamente menor que una que contenía una proporción de 140:60 en volumen de Sac:Estaq. . Las barras de error muestran el error estándar de la media (n= 8). La figura 4.2 muestra el efecto de la proporción Sac:Estac sobre la recuperación de FMDV-O TT con varias concentraciones de histona (His) de acuerdo con el documento WO-A-2006/0850082. La histona era histona 2A obtenida en Boehringer Mannheim. Las barras de error mostradas son el error estándar de la media (n= 6). La Figura 5 muestra el efecto de la optimización de las proporciones de Sac/Estac/PE sobre la recuperación de adenovirus. La formación de unidades formadoras de placas (UFP= se evaluó tras la desecación por congelación durante 12 horas y tratar con calor durante 24 horas. Los resultados demuestran que, cuando se usan los niveles más altos de Estac, las UFP del virus disminuyeron con rapidez. Cuando no hay Estac presente, las UFO se redujeron espectacularmente. Cuando se desecó por congelación solo con PBS, no había UFP. Las diluciones menores de PEI también parecían potenciar la recuperación de virus. La Figura 6 muestra la recuperación de adenovirus en PEI y azúcar. La PEI y el excipiente de azúcar se optimizaron y compararon con 3 controles; azúcares solo, PBS y el título original (antes de la desecación por congelación). La desecación por congelación con PBS solo no mostró termoprotección. Los azúcares sólo mostraron alguna actividad viral, no obstante se observó mayor actividad usando PEI junto con azúcar en el excipiente. Las barras de error representan el error estándar de la media (n= 2). La Figura 7 muestra que un excipiente que contiene Sac (1,5M)/Estac (0,125M) con PEI a una concentración de 0,02 nM parece óptima y demuestra una recuperación mejorada de adenovirus sobre solo una solución de Sac Estac solas. La PEI como el único excipiente mostró poca o ninguna protección durante la desecación por congelación. La Figura 8 muestra los resultados de un... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para conservar partículas virales, que comprende: (i) proporcionar a una solución acuosa uno o más azúcares, una polietilenimina y las partículas virales en las que la concentración de polietilenimina es inferior a 500 nM en base a la masa molar promedio en número (Mn) de la polietilenimina y la concentración de azúcar o, si hay más de un azúcar presente, la concentración total de azúcar es superior a 0,1M; y (ii) secar la solución para formar una matriz sólida amorfa que comprende dichas partículas virales. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la concentración de polietilenimina es: (a) entre 0,0025 y 200nM (b) entre 0,025 y 200nM, o (c) menos de 100nM, en base a la masa molar promedio en número (Mn) de la polietilenimina. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la Mn de la polietilenimina está entre 20 y 1000 kDa y la concentración de la polietilenimina está entre 0,001 y 100 nM en base a la Mn. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la Mn de la polietilenimina está entre 300 y 2000 Da. 5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que: (a) la concentración del azúcar, o la concentración total del azúcar, está entre 0,5 y 2M, y/o (b) el azúcar es sacarosa, estaquiosa, rafinosa o un alcohol de azúcar, y/o (c) se usa una solución de dos o más azúcares. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que se usa una solución de dos o más azúcares y la concentración de sacarosa respecto al otro azúcar está en una proporción de entre 3:7 y 9:1, y la concentración de polietilenimina en base a la Mn en la etapa (i) está entre 0,0025 nM y 100 nM. 7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla se liofiliza. 8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas virales están compuestas por un virus vivo o un virus muerto. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el virus vivo es virus entero o virus vivo atenuado. 10. Un excipiente para la conservación de partículas virales, que comprende: (a) sacarosa, estaquiosa o rafinosa o cualquier combinación de las mismas; y (b) polietilenimina a una concentración basada en la Mn inferior a 500nM. 11. Uso de un excipiente de acuerdo con la reivindicación 10 para la conservación de una partícula viral durante y después de la liofilización. 12. Un kit que comprende el excipiente de acuerdo con la reivindicación 10. 13. Un procedimiento de preparar una vacuna que comprende partículas virales, en el que el procedimiento comprende: (a) proporcionar a una solución acuosa uno o más azúcares, una polietilenimina y las partículas virales en las que la concentración de polietilenimina es inferior a 500 nM en base a la masa molar promedio en número (Mn) de la polietilenimina y la concentración de azúcar o, si hay más de un azúcar presente, la concentración total de azúcar es superior a 0,1M; y (b) opcionalmente añadir un adyuvante, tampón, antibiótico y/o aditivo a la mezcla; y (c) secar la solución para formar una matriz sólida amorfa que comprende dichas partículas virales. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la vacuna es una vacuna multivalente. 15. Un polvo seco que comprende partículas virales conservadas obtenible mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 19 E08718824 27-10-2011   E08718824 27-10-2011   21 E08718824 27-10-2011   22 E08718824 27-10-2011   23 E08718824 27-10-2011   24 E08718824 27-10-2011   E08718824 27-10-2011