Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas.
Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con bibliotecas de péptidos sintéticas in vitro que es adecuado para comprobar una respuesta inmunitaria de células T o para la preparación de una composición de linfocitos T CD8 y/o CD4 para el tratamiento in-vivo de seres humanos y animales y que comprende los siguientes pasos:
(a) subdividir la secuencia de aminoácidos de la proteína completa en fragmentos de proteína con secuencias de aminoácidos parciales, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 35 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con sus secuencias de aminoácidos parciales,
(b) sintetizar una biblioteca de péptidos que contenga los fragmentos de proteína definidos en (a) y
(c) incubar una suspensión con los linfocitos T CD8 y/o CD4 a estimular con todos los fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos en una preparación de cultivo única.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2001/001773.
Solicitante: KERN, FLORIAN.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: WOLLINER STRASSE 9 10435 BERLIN ALEMANIA.
Inventor/es: VOLK, HANS-DIETER, KERN, FLORIAN, REINKE,PETRA, FAULHABER,NICOLE, SUREL,INGOLF-PASCAL, KHATAMZAS,ELHAM.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K38/08 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen de 5 a 11 aminoácidos.
- A61K38/10 A61K 38/00 […] › Péptidos que tienen de 12 a 20 aminoácidos.
- A61K38/16 A61K 38/00 […] › Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
- A61K39/245 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Herpetoviridae, p. ej. virus del herpes simple.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
- G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.
PDF original: ES-2317894_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas.
La invención se refiere a un procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con bibliotecas de péptidos sintéticas que comprende los siguientes pasos:
El procedimiento puede utilizarse tanto para la inmunoestimulación de linfocitos T de mamíferos, en especial de seres humanos, como también para la detección de una respuesta inmunitaria de células T para comprobar si un mamífero, en especial un ser humano, ha respondido previamente contra al menos un fragmento de proteína de la proteína completa del paso (a) con su sistema inmunitario y qué intensidad tiene esta respuesta.
Antecedentes de la invención
La respuesta inmunitaria de los linfocitos T CD8 contra antígenos de proteína puede determinarse con métodos conocidos solo con grandes gastos. Esta depende de la presentación de los epítopos derivados de estos antígenos sobre moléculas de MHC de clase I en células y puede medirse midiendo una reacción citotóxica inducida por exposición. Esta disposición de ensayo es habitual y lleva de una a varias semanas, debiéndose estimular los linfocitos T CD8 con el antígeno en un cultivo celular adecuado y entonces se incuban en un ensayo de citotoxicidad con células diana adecuadas (target-cells) que se habían cargado con péptidos de este antígeno o que se habían transferido con este antígeno o partes del mismo. La inducción de una respuesta de los linfocitos T CD8 se mide por la extensión de la destrucción de las células diana, lo que exige controles adecuados e implica un gran coste experimental y de tiempo.
La determinación de la respuesta inmunitaria de los linfocitos T CD4 contra antígenos de proteína es un poco menos complicada. La respuesta de los linfocitos T CD4 contra antígenos de proteína depende de la presentación de los epítopos derivados de estos antígenos sobre moléculas de MHC de clase II en células y puede medirse por la proliferación de estas células en presencia del antígeno o tras exposición con este antígeno p. ej. por la incorporación de timidina tritiada. Esta disposición de ensayo es habitual y lleva de varios días a una semana o más. La presencia de una respuesta de linfocitos T CD4 contra antígenos de proteína puede medirse además en un procedimiento conocido en el que se incuba una suspensión que contiene linfocitos T CD4 con la correspondiente proteína y a continuación se determina la inducción de linfocitos T CD4 por la presencia de citocinas intracelulares mediante citometría de flujo.
La presencia de una respuesta de linfocitos T CD8 o de linfocitos CD4 contra distintos epítopos puede medirse además por un procedimiento conocido en el que se incuba una suspensión que contiene linfocitos T CD8 y/o CD4 con péptidos de esta proteína y a continuación se determina la inducción de linfocitos T CD8 y/o CD4 por la presencia de citocinas intracelulares mediante citometría de flujo. A este respecto se aprovecha que pueden cargarse péptidos evitando el procesamiento intracelular directamente desde fuera sobre las moléculas de MHC de clase I o de MHC de clase II en células. Mediante una disposición adecuada de péptidos en grupos en este procedimiento puede conseguirse que puedan identificarse péptidos estimuladores y con ello puedan determinarse epítopos. La disposición utilizada de este modo distribuye todos los epítopos en cuestión en varias, mayoritariamente numerosas, preparaciones, de modo que se puede determinar si distintos péptidos de esta proteína pueden inducir una respuesta de linfocitos T y puede determinarse cuales de los péptidos presentes en los distintos grupos han conducido a esta estimulación (esto se describe en F. Kern y col., Journal of Virology, Octubre 1999, p. 8179-8184 y en el documento WO 99/36568).
Esta disposición permite sin embargo o bien determinar sistemáticamente en una única medición con una correspondiente preparación de control si no hay respuesta alguna de linfocitos T contra la proteína, o bien enunciar la magnitud de la respuesta (la proporción de los reactivos en % de todos los linfocitos CD8 o CD4) contra esta proteína en total. Para ello fueron necesarias para la identificación de epítopos varias preparaciones de estimulación y medición en la disposición habitual en este procedimiento, dependiendo ello de cuantos péptidos se utilicen. La aplicación descrita en la literatura tiene por objeto la identificación precisa de epítopos y utiliza por consiguiente grupos de péptidos cuyo tamaño se elige de modo que en la determinación de una acción estimuladora de un grupo de péptidos deban ensayarse el menor número posible de péptidos individuales. Pero cuanto menor se seleccione el tamaño de los grupos tantos más grupos deben ensayarse. Como variante más adecuada se elige por consiguiente en este procedimiento un número de grupos que corresponda al doble de la raíz del cuadrado inmediatamente superior al del número de péptidos (en tanto que el número de péptidos no sea él mismo un cuadrado).
Como ejemplo es de mencionar la proteína pp65 del citomegalovirus humano. Se sintetizaron 138 péptidos que cubrían la secuencia de aminoácidos de la proteína completa (561 aminoácidos) en toda su longitud, solapándose los péptidos contiguos en respectivamente 9 aminoácidos. 138 no es ningún cuadrado. El cuadrado inmediatamente superior a 138 es 144 (12x12). Se distribuyeron pues los péptidos en 2 x 12, es decir 24, grupos, de modo que cada péptido estaba presente en exactamente dos grupos distintos. Mediante la combinación de los grupos con resultados positivos (estimulación) puede ponerse en claro directamente el péptido estimulador (en solo dos grupos con resultados positivos) o un pequeño número de péptidos candidatos que pueden ensayarse después individualmente en el caso de que más de dos grupos de péptidos hayan conducido a resultados de estimulación positivos. El principio de esta disposición está detalladamente descrito en F. Kern y col., Journal of Virology, Octubre 1999, p. 8179-8184. Una posibilidad de poder afirmar en una única preparación con correspondiente control negativo si una proteína tiene efecto estimulador sobre linfocitos T CD8, si de este modo están presentes en la secuencia de aminoácidos de esta proteína de linfocitos T CD8 epítopos identificados, no se ha descrito hasta ahora.
Descripción de la invención
Es objetivo de la invención ofrecer una posibilidad de cómo pueden utilizarse antígenos de proteína con secuencia conocida para la inmunoestimulación de linfocitos T CD8 y CD4, no siendo necesario un procesamiento de antígenos celular y no debiéndose identificar determinantes antigénicos (epítopos) individuales. Se ha encontrado ahora que puede conseguirse una suficiente inmunoestimulación por incubación de una biblioteca de péptidos especial de fragmentos individuales del antígeno con un cierto solapamiento de los fragmentos con linfocitos T. La estimulación puede determinarse a este respecto por citometría de flujo. De este modo puede establecerse si un organismo (de tipo humano o animal) tras haber tenido lugar una exposición (también inmunización selectiva) ha organizado una respuesta de linfocitos T contra el antígeno inmunizador. Esta reactividad de linfocitos T puede analizarse en el transcurso del tiempo. Es además objetivo de la invención ofrecer un procedimiento con el que puedan identificarse antígenos de proteína cuyas secuencias de aminoácidos son conocidas en poco tiempo y con un coste comparativamente pequeño como antígenos de proteína estimuladores de linfocitos T. Con ello se da además una posibilidad, antes de la elección de una proteína para la identificación de epítopos, de analizar si en suma están presentes en esta proteína determinantes antigénicos estimuladores de linfocitos T.
La presente invención se refiere por consiguiente a
(1) un procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con bibliotecas de péptidos sintéticas in vitro que es adecuado para comprobar una respuesta inmunitaria de células T o para la preparación de una composición de linfocitos T CD8 y/o CD4 para el tratamiento in-vivo de seres humanos y animales y que comprende los siguientes pasos:
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que los fragmentos de proteína presentan una longitud máxima de 25 AA.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 ó 2, en el que entre los fragmentos de proteína contiguos existe un solapamiento de 8 AA, preferiblemente de 11 AA.
4. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los fragmentos de proteína sintéticos están prolongados en el N terminal y/o en el C terminal con un máximo de 7 AA naturales o artificiales y/o un grupo protector.
5. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de los distintos fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos asciende en la preparación de cultivo al menos a 1 ng/ml, preferiblemente a 0,1 a 10 μg/ml.
6. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, en el que a la solución de incubación se le añaden uno o más compuestos con propiedades coestimuladoras seleccionados entre los anticuerpos coestimuladores, como por ejemplo anti-C28 y anti-CD49d, y CTLA4-Ig.
7. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, en el que en el procedimiento antes del paso (a) se determina la secuencia de aminoácidos completa de la proteína completa.
8. Procedimiento para la identificación de mezclas estimuladoras o no estimuladoras de todos los fragmentos de proteína en una única preparación de cultivo, comprendiendo el procedimiento tras los pasos (a) a (c) de la reivindicación 1 además los siguientes pasos:
9. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, que es adecuado para determinar si hay determinantes antigénicos estimuladores de linfocitos T presentes en un antígeno.
10. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, que es adecuado para la inmunoestimulación in-vitro de linfocitos T de mamíferos, en especial de seres humanos.
11. Procedimiento conforme a la reivindicación 10 que además comprende la expansión de los linfocitos T estimulados.
12. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, que es adecuado para la detección de una respuesta inmunitaria de células T, concretamente para comprobar si un mamífero, en especial un ser humano, ha respondido previamente contra al menos un fragmento de proteína de la proteína completa del paso (a) de la reivindicación 1 con su sistema inmunitario y qué intensidad tiene esta respuesta.
13. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende los usos de varias bibliotecas de péptidos sintéticas distintas, realizándose la incubación de las bibliotecas de péptidos con la suspensión de los linfocitos T CD8 y/o CD4 conjuntamente en una preparación de cultivo o en preparaciones de cultivo independientes.
14. Composición de linfocitos T CD8 y CD4 estimulados que se pueda obtener conforme a la reivindicación 10 u 11.
15. Composición de linfocitos T CD8 y CD4 estimulados conforme a la reivindicación 14 que es adecuada para trasfundirse a un paciente.
16. Uso de las mezclas estimuladoras identificadas en la reivindicación 8 que contienen los fragmentos de proteína con secuencias de AA parciales de la secuencia de AA completa de la proteína completa, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 35 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con sus secuencias de aminoácidos parciales, para la preparación de un medicamento para la estimulación de linfocitos T CD8 y CD4 dirigidos contra la proteína completa anteriormente indicada para la inmunoterapia específica de antígeno en infecciones víricas y alergias.
17. Uso de la composición de linfocitos T CD8 y CD4 que puede obtenerse conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, 9 y 10 para la preparación de un medicamento para la inmunoterapia específica de antígeno en infecciones víricas y alergias, incluida la inmunoterapia adoptiva.
18. Composición para la inmunoestimulación in-vitro de linfocitos T de mamíferos, que comprende las mezclas estimuladoras identificadas en la reivindicación 8 que contienen los fragmentos de proteína con secuencias de AA parciales de la secuencia de AA completa de la proteína completa, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 35 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con sus secuencias de aminoácidos parciales.
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