Método de detección o seguimiento de una enfermedad maligna de las células plasmáticas,

que comprende detectar en una muestra la proporción entre las cantidades relativas de inmunoglobulinas que presentan: (i) una clase de cadena pesada unida a cadenas ligeras &955;, e (ii) inmunoglobulinas que presentan la misma clase de cadena pesada aunque unidas a cadenas ligeras &954;, en donde la proporción se determina utilizando: (i) un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que presenta especificidad para una clase de cadena pesada, presentando simultáneamente para una primera cadena ligera, en combinación con: (ii) un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que presenta especificidad para la clase de cadena pesada, presentando simultáneamente especificidad para la segunda cadena ligera.

La invención se refiere a ensayos y métodos para la detección o seguimiento de la enfermedad maligna de las células plasmáticas, y a anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, que son específicos para las inmunoglobulinas, comprendiendo las inmunoglobulinas una cadena ligera unida a una cadena pesada, caracterizándose adicionalmente el anticuerpo o fragmento aislado por presentar especificidad para una clase de cadena pesada (también conocida como clase de cadena pesada) y simultáneamente presentando especificidad para un tipo de cadena ligera. También se proporcionan composiciones y métodos de utilización de los anticuerpos, por ejemplo en la detección de una enfermedad maligna de las células plasmáticas, tal como el mieloma.

Las moléculas de anticuerpo (también conocidas como inmunoglobulinas) presentan una simetría binaria y están compuestos de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, conteniendo cada una dominios variable y constante. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras se combinan formando un sitio de unión a antígeno, de manera que ambas cadenas contribuyen a la especificidad de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo. La estructura tetramérica básica de los anticuerpos comprende dos cadenas pesadas unidas covalentemente mediante un enlace disulfuro. Cada cadena pesada, a su vez, se encuentra unida a una cadena ligera, nuevamente mediante un enlace disulfuro. Lo anterior resulta en una molécula sustancialmente en forma de "Y". Se muestra esto esquemáticamente en la figura 1.

Las cadenas pesadas son las mayores de los dos tipos de cadena presentes en los anticuerpos, con una masa molecular típica de entre 50.000 Da y 77.000 Da, en comparación con las cadenas ligeras, que son menores

(25.000 Da).

Existen cinco clases principales de cadena pesada, que son y, a, µ,δ y ε, que son las cadenas pesadas constituyentes de: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, respectivamente. IgG es la inmunoglobulina principal del suero humano normal, constituyendo entre 70% y 75% del total de inmunoglobulinas. Es el anticuerpo principal de las respuestas inmunológicas secundarias. Forma un único tetrámero de dos cadenas pesadas más dos cadenas ligeras.

IgM constituye aproximadamente 10% del total de inmunoglobulinas. Las moléculas, conjuntamente con las cadenas J, forman un pentámero de cinco de las estructuras básicas de 4 cadenas. Las cadenas pesadas individuales presentan un peso molecular de aproximadamente 65.000 y la molécula completa presenta un peso molecular de aproximadamente 970.000. IgM se encuentran mayoritariamente restringida al conjunto intravascular de inmunoglobulinas y es el anticuerpo temprano predominante.

IgA representa 15% a 20% del conjunto de inmunoglobulinas séricas en el ser humano. Más de 80% de la IgA se encuentra en forma de monómero. Sin embargo, algunas de las IgA (IgA secretorias) existen en forma dimérica.

IgD constituye menos de 1% del total de inmunoglobulinas plasmáticas.

IgE, aunque escaso en el suero normal, se encuentra sobre la membrana superficial de basófilos y mastocitos. Se asocia a enfermedades alérgicas tales como el asma y la fiebre del heno.

Además de las cinco clases principales o clases, existen cuatro subclases de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Además, existen dos subclases de IgA (IgA1 e IgA2).

Existen dos tipos de cadena ligera: lambda (λ) y kappa (κ). En el ser humano se produce aproximadamente el doble de moléculas de κ que de λ, aunque ello difiere bastante en algunos mamíferos. Cada cadena contiene aproximadamente 220 aminoácidos en una única cadena polipeptídica que se pliega formando un dominio constante y un dominio variable. Las células plasmáticas producen uno de los cinco tipos de cadena pesada conjuntamente con las moléculas κ ó λ. Normalmente se produce un exceso de aproximadamente 40% de cadenas ligeras libres respecto a la síntesis de cadenas pesadas. Las moléculas de cadena ligera que no se unen a moléculas de cadena pesada se conocen como "moléculas de cadena ligera libres". Las cadenas ligeras κ habitualmente se encuentran en forma de monómero. Las cadenas ligeras λ tienden a formar dímeros.

Existen varias enfermedades proliferativas asociadas a las células productoras de anticuerpos. La figura 2 muestra el desarrollo del linaje de células B y las enfermedades asociadas. Estas enfermedades se conocen como enfermedades malignas de las células plasmáticas. Se resumen en detalle en la obra "Serum-free Light Chain Analysis", A.R. Bradwell, disponible de The Binding Site Limited, Birmingham, Reino Unido (ISBN: 07044 24541).

En muchas de dichas enfermedades proliferativas, una célula plasmática prolifera formando un tumor monoclonal de células plasmáticas idénticas. Ello resulta en la producción de grandes cantidades de inmunoglobulinas idénticas y se conoce como gammopatía monoclonal.

Algunas enfermedades tales como el mieloma y la amiloidosis sistémica primaria (amiloidosis AL) constituyen aproximadamente 1,5% y 0,3% respectivamente de las muertes por cáncer en el Reino Unido. El mieloma múltiple es la segunda forma más común de malignidad hematológica tras el linfoma no de Hodgkin. En las poblaciones caucásicas, la incidencia es de aproximadamente 40 por millón al año. Convencionalmente el diagnóstico del mieloma múltiple se ha basado en la presencia de un exceso de células plasmáticas monoclonales en la médula ósea, inmunoglobulinas monoclonales en el suero o en la orina y alteraciones relacionadas en órganos

**(Ver fórmula)**

o tejidos, tales como hipercalcemia, insuficiencia renal, anemia o lesiones óseas. El contenido normal de las células plasmáticas de la médula ósea es de aproximadamente 1%, mientras que en el mieloma múltiple el contenido típicamente es superior al 30%, pero puede ser superior al 90%.

La amiloidosis AL es un trastorno de la conformación de las proteínas caracterizado por la acumulación de fragmentos de cadena monoclonal libre en forma de depósitos de amiloide. Típicamente, estos pacientes se presentan con insuficiencia cardiaca o renal, aunque pueden encontrarse implicados nervios periféricos y otros órganos.

Existen algunas otras enfermedades que pueden identificarse a partir de la presencia de inmunoglobulinas monoclonales en el torrente sanguíneo, o efectivamente en la orina, de un paciente. Entre ellas se incluyen el plasmacitoma y el plasmacitoma extramedular, un tumor de células plasmáticas que aparece fuera de la médula ósea y que puede producirse en cualquier órgano. En este tumor la proteína monoclonal típicamente es IgA. Pueden producirse múltiples plasmacitomas solitarios, con o sin evidencia de mieloma múltiple. La macroglobulinemia de Waldenström es un trastorno linfoproliferativo de grado bajo que se asocia a la producción de IgM monoclonal. Aparecen aproximadamente 1.500 nuevos casos cada año en los Estados Unidos, y 300 en el Reino Unido. La cuantificación de la IgM sérica resulta importante tanto para el diagnóstico como el seguimiento. Los linfomas no de Hodgkin de las células B causan aproximadamente 2,6% del total de muertes por cáncer en el Reino Unido, y se han identificado inmunoglobulinas monoclonales en el suero de aproximadamente 10% a 15% de los pacientes mediante métodos estándares de electroforesis. Los informes iniciales indican que las cadenas ligeras monoclonales libres pueden detectarse en la orina de 60% a 70% de los pacientes. En la leucemia linfocítica crónica de las células B, se han identificado proteínas monoclonales mediante el inmunoensayo de las cadenas ligeras libres.

Además, existen condiciones denominadas MGUS. Éstas son gammopatías monoclonales de significación indeterminada. Este término se refiere a la presencia inesperada de una inmunoglobulina monoclonal intacta en individuos que no presentan indicios de mieloma múltiple, amiloidosis AL, macroglobulinemia de Waldenström, etc. Las MGUS pueden encontrarse en 1% de la población de más de 50 años, en 3% de las de más de 70 años y hasta 10% de la de más de 80 años de edad. La mayoría de ellas se relacionan con IgG o IgM, aunque más raramente pueden relacionarse con IgA o ser biclonales. Aunque la mayoría de personas con MGUS muerte de enfermedades no relacionadas, MGUS puede transformarse en una gammopatía monoclonal maligna.

En por lo menos algunos casos de las enfermedades subrayadas anteriormente, las enfermedades... [Seguir leyendo]

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Método de detección o seguimiento de una enfermedad maligna de las células plasmáticas, que comprende detectar en una muestra la proporción entre las cantidades relativas de inmunoglobulinas que presentan:

(i) una clase de cadena pesada unida a cadenas ligeras λ, e

(ii) inmunoglobulinas que presentan la misma clase de cadena pesada aunque unidas a cadenas ligeras κ, en donde la proporción se determina utilizando:

(i) un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que presenta especificidad para una clase de cadena pesada, presentando simultáneamente para una primera cadena ligera, en combinación con:

(ii) un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que presenta especificidad para la clase de cadena pesada, presentando simultáneamente especificidad para la segunda cadena ligera.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es específico de subclase de cadena pesada.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proporción se determina utilizando un ensayo de inmunosorción, tal como ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) que comprenden los anticuerpos.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la unión de los anticuerpos a las inmunoglobulinas en la muestra se determina mediante la utilización de un nefelómetro, un turbidímetro, citometría de flujo o perlas marcadas fluorescentemente.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de detectar la presencia y/o cantidad de cadenas ligeras λ y/o κ libres en la muestra.

6. Método según la reivindicación 5, en el que las cadenas ligeras λ y/o κ libres se detectan con anticuerpos específicos para las cadenas ligeras λ libres o las cadenas ligeras κ libres.

7. Anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos, que son específicos para una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, estando dichos anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos caracterizados adicionalmente porque presentan especificidad para una clase de cadena pesada, presentando simultáneamente especificidad para un tipo de cadena ligera.

8. Anticuerpos o fragmentos de los mismos, según la reivindicación 7, que son anticuerpos policlonales.

9. Anticuerpos o fragmentos de los mismos, según la reivindicación 7 ó 8, que son específicos para IgG-λ, IgG-κ, IgA-λ, IgA-κ, IgM-λ, IgM-κ, IgD-λ, IgD-κ, IgE-λ o IgE-κ.

10. Anticuerpos o fragmentos de los mismos, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en los que los anticuerpos son específicos de subclase de cadena pesada.

11. Fragmento de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que es un fragmento Fab o F(ab')2.

12. Composición que comprende una pluralidad de anticuerpos policlonales o fragmentos de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

13. Anticuerpos o fragmentos de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 inmovilizados sobre un sustrato.

14. Anticuerpos o fragmentos de los mismos, según la reivindicación 13, en los que el sustrato es poliestireno y/o látex.

15. Anticuerpos o fragmentos de los mismos, según la reivindicación 14, en los que el sustrato es una perla de látex de poliestireno.

16. Anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 13, en los que el sustrato es una micromatriz o una placa de microtitulación.

17. Anticuerpos o fragmentos de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16 que se encuentran marcados.

18. Kit de ensayo de inmunosorción, tal como un kit de ensayo ELISA, para la utilización en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un anticuerpo, o un fragmento del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17.

19. Kit de citometría de flujo, perlas marcadas fluorescentemente o kit de micromatrices, para la utilización en un método según las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17.

20. Kit según la reivindicación 19, que comprende dos tipos diferentes de anticuerpo específicos para diferentes

clases de cadena pesada y/o tipos diferentes de cadena ligera, y los tipos diferentes de anticuerpos se soportan sobre tamaños diferentes de perla y/o se marcan con marcajes detectables diferentes.

21. Kit para la detección de una molécula específica de inmunoglobulina, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17.

22. Método para diagnosticar una enfermedad maligna de las células plasmáticas, que comprende la utilización de un método, anticuerpo, fragmento o kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para someter a ensayo una muestra de sangre, orina o suero.