HMGB1 y anticuerpos anti-HMGB1 en pacientes infectados por VIH especialmente con trastornos neurológicos.

Un método in vitro para cuantificar los anticuerpos específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1)contenida en una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida de un sujeto,

que comprende:

a) poner en contacto dicha muestra de líquido cefalorraquídeo con proteína HMGB1 nativa o derivados de

proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y

b) cuantificar los anticuerpos específicos para HMGB1.

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HMGB1 y anticuerpos anti-HMGB1 en pacientes infectados por VIH especialmente con trastornos neurológicos

Antecedentes de la invención Campo de la invención La solicitud se refiere a la cuantificación de la proteína HMGB1 o de los anticuerpos específicos para HMGB1 en una muestra biológica, en particular suero y Líquido Cefalorraquídeo (LCR) y su correlación respectiva con la supervisión de la infección por VIH o con la carga viral así como métodos de pronóstico del estado de progresión del SIDA y trastornos neurológicos asociados con SIDA.

Descripción de la técnica relacionada Poco después de la infección, el VIH-1 es capaz de penetrar en el cerebro, dando como resultado con el tiempo complicaciones asociadas con VIH en el sistema nervioso central (SNC) . La demencia asociada con VIH (HAD) está caracterizada clínicamente por disfunciones motoras y conductuales que conducen a ataques, coma y muerte en un periodo de 6 meses después de la aparición. La encefalitis por VIH, el correlacionado patológico de HAD, se caracteriza por astrogliosis generaliza, tensión oxidativa, desregulación de citocinas/quimiocinas y degeneración neuronal (Gonzalez-Scarano y Martin-Garcia, Nat Rev Immunol 2005, 5: 69-81) . Puesto que las neuronas no se ven afectadas por VIH-1, la opinión actual es que estas células se dañan indirectamente por quimiocinas proinflamatorias liberadas por células gliales activadas. IP-10 (CXCL10) es una quimiocina neurotóxica que está regulada positivamente en astroglía y se ha sugerido que potencia la infección por retrovirus y media en la lesión neuronal. Se ha notificado la elevación de IP-10 en LCR en infección por VIH, y su nivel se ha correlacionado con la carga viral de VIH en LCR (Cinque P et al. J Neuroimmunol 2005, 168: 154) . También se ha notificado una posible asociación entre los niveles de proteína quimioatrayente de macrófagos 1 LCR (MCP-1 o CCL2) y el desarrollo de HAD en una cohorte que ha experimentado HAART con infección por VIH avanzada (Sevigny JJ, Albert SM, McDermott MP; et al. Neurology. 2004; 63: 2084) . Otro estudio presentó una asociación entre los niveles de MCP-1 en plasma y demencia asociada a VIH (Sevigny et al. Arch. Neurol. 2007, 64: 97) .

La proteína de caja de grupo de alta movilidad 1 (HMGB1) es una proteína cromosómica no histona que actúa como una citocina proinflamatoria potente cuando se secreta de forma activa de macrófagos, monocitos, células dendríticas y otras células activadas tales como linfocitos NK. HMGB1 se comporta como un desencadenante de inflamación, atrayendo células inflamatorias y de reparación de tejido, reclutando células madre y promoviendo su proliferación. Además, HMGB1 activa células dendríticas (CD) y promueve su maduración funcional y su respuesta a quimiocinas de ganglios linfáticos. Los leucocitos activados secretan de forma activa HMGB1 en el microambiente. De este modo HMGB1 actúa de una manera autocrina/paracrina y mantiene programas de reparación y defensa a largo plazo (Bianchi y Manfredi, 2007; Lotze y Tracey, 2005) .

Sobajima et al, Clin Exp Immunol (1998) 111: 402-407 describen la prevalencia de anticuerpos citoplásmicos perinucleares antineutrófilos (P-ANCA) dirigidos contra HMGB1 en colitis ulcerosa.

En recientes estudios, se ha mostrado que HMGB1 desencadena replicación de VIH en CD infectadas por VIH,

contribuyendo de este modo a la constitución de depósitos virales en CD (Saidi H, Melki M-T, Gougeon M-L, PLoS One 2008) . Considerando que las CD son las primeras dianas para VIH en las primeras horas de infección de la mucosa, que después migrarán a órganos linfoides secundarios cuando transmitan VIH a linfocitos T, estos hallazgos plantean la cuestión de la implicación in vivo de HMGB1 en el desencadenamiento de la replicación viral y suministro de depósitos virales. Se produjo HMGB1 durante una comunicación entre CD infectadas por VIH y linfocitos NK activados, dando como resultado también resistencia de CD infectadas por VIH a muerte por NK. La supervivencia de CD se asoció con la regulación positiva de dos inhibidores de apoptosis, c-IAP2 y c-FLIP en CD infectadas, un proceso inducido por HMGB1 (Melki M-T et al. PLoS Pathogens 2010, en prensa) . El bloqueo de la actividad de HMGB1 por inhibidores específicos, tales como glicirricina o anticuerpos de bloqueo, anula la replicación de VIH en CD infectadas (Saidi H, Melki M-T, Gougeon M-L, PLoS One 2008) y restaura la 55 susceptibilidad de CD infectadas a muerte por NK (Melki M-T et al. PLoS Pathogens 2010, en prensa) . Estos hallazgos, que proporcionan nueva información sobre como el VIH secuestra las CD para promover la diseminación viral y mantener la viabilidad de depósitos a largo plazo, ha sido el objeto de la solicitud de patente PCT/EP2009/06828.

Estos hallazgos también plantean la cuestión de la implicación in vivo de HMGB1 en el desencadenamiento de replicación viral y suministro de depósitos virales. Para abordar esta cuestión, se ha cuantificado la concentración de HMGB1 en suero de pacientes infectados por VIH (Elisa, Shino test, IBL) para evaluar la contribución in vivo de HMGB1 en circulación a la carga viral de VIH en plasma y a la evolución de la enfermedad. Además, considerando que pudieron encontrarse autoanticuerpos específicos para HMGB1 en enfermedades autoinmunes tales como SLE

(lupus) (Hayashi et al., 2009) , se desarrolló un ensayo de Elisa específico para comprobar si se detectaron anticuerpos específicos anti-HMGB1 en suero de pacientes infectados por VIH en enfermedad de VIH.

Se ha presentado la medida tanto de HMGB1 como de anticuerpos anti-HMGB1 en suero de pacientes en la solicitud de patente PCT/EP2009/06828. Se han extraído las siguientes conclusiones:

(i) la infección por VIH crónica desencadena la producción de HMGB1, detectado a niveles aumentados en 5 suero de pacientes infectados, lo que a su vez induce la producción de anticuerpos neutralizantes;

(ii) se detecta una correlación inversa entre HMGB1 y Ab anti-HMGB1, lo que indica que cuando HMGB1 se une a los anticuerpos, este ya no se detecta en muestras de suero;

(iii) cuantos más anticuerpos anti-HMGB1 en suero (lo que quiere decir que se ha producido más HMGB1 anteriormente) , menos linfocitos T CD4, lo que sugiere que los niveles aumentados de anticuerpos anti-HMGB1 en suero están asociados con la evolución de la enfermedad; y

(iv) la terapia antirretroviral potente (HAART) reduce los niveles en suero tanto de HMGB1 como de anticuerpos anti-HMGB1 y puede normalizarlos por debajo de los niveles de la línea basal.

La solicitud de patente PCT/EP2009/06828 también ha planteado la hipótesis de que cuantos más anticuerpos anti

HMGB1 en suero, menor carga viral en suero. Sin embargo, esta hipótesis no se ha confirmado en un análisis exhaustivo de los experimentos realizados y en una cohorte mayor de pacientes. De hecho, se ha mostrado además que la correlación establecida entre anticuerpos anti-HMGB1 y la carga viral en suero divulgada en la patente PCT/EP2009/06828 derivaba de un análisis estadístico indebido de los resultados derivados de una cohorte de pacientes que abarcan tanto pacientes no tratados como pacientes tratados (tratamiento que tiene un efecto en la carga viral) .

Descripción de la invención La presente invención aborda la cuestión de métodos basados en la cuantificación de HMGB1 y anticuerpos anti

HMGB1 para supervisar la infección por VIH y en algunos casos para supervisar la carga viral, así como la cuestión de la posible implicación de HMGB1, anticuerpos anti-HMGB1 y otras quimiocinas en el método de pronóstico de la aparición del SIDA y trastornos neurológicos asociados con el SIDA o infección por VIH.

HMGB1 es una proteína bien conocida que aparece en el núcleo y también se sabe que es una citocina. Las características funcionales y físicas de HMGB1 se desvelan en y se incorporan por referencia a Lotze, et al., Nature Reviews, Immunology 5: 351 (2005) .

Se conocen anticuerpos que se unen a HMGB1 y pueden producirse por métodos bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de anticuerpos anti-HMGB1 disponibles en el mercado son anticuerpos policlonales primarios de Conejo para HMGB1 humana (Abcam ref. 18256) que se dirigen contra un péptido sintético conjugado con KLH derivado de los restos 150 al C terminal de HMGB1 humana. Estos métodos incluyen los que producen anticuerpos policlonales para HMGB1 y anticuerpos monoclonales para HMGB1 o para fragmentos específicos de HMGB1. Los anticuerpos usados en aplicaciones terapéuticas tienen la característica de ser bloqueantes, por ejemplo, especialmente interfieren con la replicación de VIH inducida por HMGB1 en células dendríticas... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para cuantificar los anticuerpos específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1) contenida en una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida de un sujeto, que comprende:

a) poner en contacto dicha muestra de líquido cefalorraquídeo con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y b) cuantificar los anticuerpos específicos para HMGB1.

2. Un método in vitro, para supervisar la infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) de un sujeto que se sabe que está infectado con VIH que comprende llevar a cabo el método como se ha definido en la reivindicación 1 en el que, antes de poner en contacto la muestra de líquido cefalorraquídeo con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1, se lleva a cabo una etapa de tratar la muestra de líquido cefalorraquídeo mediante un tratamiento ácido para disociar

los complejos inmunitarios hallados en la muestra, preferentemente con Glicina 1, 5 M a un pH bajo, y donde en dicho método, cuantificar los anticuerpos específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1) de una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida de dicho sujeto, es cuantificar los anticuerpos totales específicos para HMGB1.

3. Un método in vitro, para supervisar la infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) de un sujeto que se sabe que está infectado con VIH, que comprende cuantificar los anticuerpos específicos para HMGB1 de una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida de dicho sujeto por un método como se ha definido en la reivindicación 1, en el que dichos anticuerpos son la fracción en circulación (anticuerpos en circulación) o su fracción en complejo inmunológico.

4. Un método de pronóstico in vitro del estado de progresión del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) o el estado de progresión hacia SIDA, de un paciente infectado por VIH, que comprende:

a) poner en contacto una muestra, en particular una muestra de suero o una de líquido cefalorraquídeo o tanto una muestra de suero como una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenida de dicho paciente después de la infección, y preferentemente durante infección primaria o aguda o durante infección crónica, con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y b) cuantificar los anticuerpos específicos para HMGB1;

donde cuanto mayor sea el nivel de anticuerpos específicos para HMGB1, mayor será el riesgo de desarrollar SIDA

o un estado avanzado de SIDA.

5. Un método de pronóstico in vitro del estado de progresión de trastornos neurológicos asociados con infección por VIH o el estado de progresión hacia trastornos neurológicos asociados con infección por VIH, de un paciente infectado con VIH, que comprende:

a) poner en contacto una muestra, en particular una muestra de suero o una de líquido cefalorraquídeo o tanto una muestra de suero como una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenida de dicho paciente después de la 45 infección, y preferentemente durante infección primaria o aguda o durante infección crónica, con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y b) cuantificar los anticuerpos específicos para HMGB1;

donde cuanto mayor sea el nivel de anticuerpos específicos para HMGB1, mayor será el riesgo de desarrollar trastornos neurológicos asociados con infección por VIH o de desarrollar un estadio avanzado de trastornos neurológicos asociados con infección por VIH.

6. Un método in vitro para evaluar la deficiencia inmunitaria de un sujeto que se sabe que está infectado con VIH 55 que comprende:

a) poner en contacto una muestra, en particular una muestra de suero o una de líquido cefalorraquídeo o tanto una muestra de suero como una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenida de dicho paciente después de la infección, con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y b) cuantificar los anticuerpos específicos para HMGB1;

donde cuantos más anticuerpos específicos para HMGB1, más alta será la deficiencia inmunitaria.

7. Un método in vitro para determinar el nivel de activación inmunitaria en un sujeto que se sabe que está infectado con VIH que comprende: a) poner en contacto una muestra, en particular una muestra de suero o una de líquido cefalorraquídeo, o tanto una muestra de suero como una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenida de dicho paciente después de la infección, con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y

b) cuantificar los anticuerpos específicos para HMGB1;

donde cuantos más anticuerpos específicos para HMGB1, más persistente será la activación inmunitaria.

8. Un método in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, que comprende además la cuantificación de otras moléculas halladas en la muestra de líquido cefalorraquídeo tales como quimiocinas, y preferentemente la cuantificación de la quimiocina IP-10 y/o la quimiocina MCP-1.

9. Un método in vitro para supervisar la condición de un sujeto que se sabe que está infectado con VIH, que comprende cuantificar en particular en una muestra de suero o en una de líquido cefalorraquídeo o tanto en una

muestra de suero como en una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenida de dicho paciente después de la infección:

a) los anticuerpos específicos para Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1) , por un método que comprende poner en contacto dicha muestra o dichas muestras con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y b) la quimiocina IP-10 y/o la quimiocina MCP-1.

10. Un método de pronóstico in vitro del estado de progresión de trastornos neurológicos asociados con infección por VIH o el estado de progresión hacia trastornos neurológicos asociados con infección por VIH, de un paciente infectado con VIH, que comprende cuantificar, en una muestra, en particular una muestra de suero o una de líquido cefalorraquídeo o tanto en una muestra de suero como en una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenida de dicho paciente después de la infección:

a) los anticuerpos específicos para Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1) , por un método que comprende poner en contacto dicha muestra o dichas muestras con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1; y b) la quimiocina IP-10 y/o la quimiocina MCP-1;

donde cuanto mayor sea el nivel de anticuerpos específicos para HMGB1 y más la quimiocina IP-10 y/o más la 35 quimiocina MCP-1, mayor será el riesgo de desarrollar trastornos neurológicos asociados con infección por VIH o de desarrollar un estadio avanzado de trastornos neurológicos asociados con infección por VIH.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, que comprende además, antes de poner en contacto dicha muestra con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan a anticuerpos específicos para HMGB1, una etapa de tratar dicha muestra por un tratamiento ácido para disociar los complejos inmunitarios hallados en la muestra, preferentemente con Glicina 1, 5 M a un pH bajo, y donde en dicho método, la cuantificación se refiere a los anticuerpos totales específicos para Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1) .

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, donde en dicho método la cuantificación se refiere a la fracción en circulación (anticuerpos en circulación) o la fracción en complejo inmunológico de los anticuerpos específicos para Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1) .

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el derivado de proteína HMGB1 se selecciona del grupo que consiste en una HMGB1 recombinante, una parte inmunológicamente reactiva de HMGB1, una parte inmunológicamente reactiva de HMGB1 cuya secuencia es común a las proteínas de HMGB1 de diversos orígenes y la BOXB recombinante de HMGB1 correspondiente a la secuencia común a ser humano y ratón de HMGB1.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además la determinación de la carga viral en dicho sujeto o paciente.

15. Un método in vitro para supervisar la infección por VIH en un sujeto infectado con VIH, que comprende cuantificar la proteína de Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1) contenida en una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida de dicho sujeto, donde dicha proteína HMGB1 a la que se dirige la cuantificación es HMGB1 total o su fracción en circulación (HMGB1 en circulación) o su fracción en complejo inmunológico.

16. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicha HMGB1 cuantificada se compara con la

cantidad de HMGB1 de una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida de un sujeto no infectado con VIH, o con la 65 cantidad de HMGB1 de una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida del mismo sujeto en un momento diferente.

17. Un método in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicho VIH es VIH-1 o VIH-2.