CITOCINAS AVIARES NOVEDOSAS Y SECUENCIAS GENÉTICAS QUE CODIFICAN PARA LAS MISMAS.

Citocinas aviares novedosas y secuencias genéticas que codifican para las mismas La presente invención se refiere en general a polipéptidos recombinantes que tienen propiedades de citocina aviar o propiedades similares a citocina aviar y a secuencias genéticas que codifican para las mismas. Más particularmente, la presente invención se refiere a polipéptidos de interferón tipo II aviar recombinante y específicamente a un interferón aviar (IFN) y a usos del mismo como modulador de la respuesta inmunitaria y como agente potenciador del crecimiento. Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que se hace referencia en esta memoria descriptiva por el autor se recogen al final de la descripción. Los números de identidad de secuencia (SEQ ID NO.) para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se definen tras la bibliografía. A lo largo de toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra comprender, o variaciones tales como comprende o que comprende implican la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros. La sofisticación en rápido crecimiento de la tecnología de ADN recombinante facilita enormemente la investigación en los campos médico y veterinario. La investigación en citocinas es de particular importancia, especialmente puesto que estas moléculas regulan la proliferación, diferenciación y función de una gran variedad de células, tales como células implicadas en la mediación de una respuesta inmunitaria. La administración de citocinas recombinantes o la regulación de la función y/o síntesis de citocinas se está convirtiendo, de manera creciente, en el centro de la investigación médica en el tratamiento de una gama de estados patológicos en seres humanos y animales. En mamíferos, los interferones (IFN) representan una familia de citocinas que comparten la capacidad para inhibir la replicación viral y ejercer efectos sobre la función inmunitaria. Existen dos tipos distintos de IFN. El IFN tipo I lo produce una variedad de tipos de células en respuesta a la infección viral e incluye a IFN y . Normalmente, el IFN lo producen leucocitos tales como monocitos y macrófagos mientras que los fibroblastos y las células epiteliales son la fuente principal de IFN. Los IFN tipo I comparten un alto grado de homología de aminoácidos, se unen al mismo receptor de superficie celular y sus funciones biológicas son resistentes al tratamiento con pH bajo y calor. (Weissmann y Weber, 1986). En cambio, la producción de IFN tipo II en mamíferos se restringe a células T activadas y células NK y está codificada por un gen que no está relacionado con los que expresan IFN o IFN. Las características que distinguen IFN de / incluye su unión a receptores de superficie celular diferentes y que el primero es sumamente sensible al tratamiento con pH bajo y calor (Weissmann y Weber, 1986). Otra diferencia es la capacidad de IFN, pero no de IFN o IFN, para estimular que los macrófagos produzcan productos intermedios de nitrógeno reactivos tales como óxido nítrico, nitrato y nitrito (Fast et al., 1993; Huang et al., 1993). Las células T de pollo producen IFN tras la estimulación con antígeno o mitógeno (Prowse y Pallister, 1989; Lowenthal et al., 1993; Pusztai et al., 1986; Weiler y von Bulow, 1987; Dijkmans et al., 1990) tal como se mide mediante la capacidad para proteger fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) frente a la lisis mediada por virus. Existe controversia con respecto a si esta actividad de IFN es el equivalente de tipo I o tipo II de IFN de mamífero (Lillehoj et al., 1992). De hecho, se ha cuestionado la existencia de IFN- en especies aviares (Dijkmans et al., 1990). Lillehoj et al. (1993a) tratan IL-2 aviar e interferón-. Lillehoj et al. (1993b) notifican la purificación parcial de IL-2 e IFN- a partir de linfocitos de pollo. El gen para IFN tipo I de pollo (ChIFN-) se ha clonado recientemente (Sekellick et al., 1994) y cuando se comparó la proteína con IFN de mamífero se mostró que tenía un 20-24% de identidad de secuencia de aminoácidos con IFN tipo I, mientras que no estaba relacionada con polipéptidos de IFN- de mamífero. Además, se mostró que ChIFN- recombinante tiene actividad antiviral, pero carece de función de activación de macrófagos porque no puede inducir la secreción de nitrito en monocitos (Schultz et al., 1995), lo que concuerda con las propiedades de IFN tipo I de mamífero. En el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores han generado varias líneas de células T de pollo únicas a partir de cultivos de células de bazo transformadas con el virus de la reticuloendoteliosis (VRE) (Lowenthal et al., 1995a,b). Estas líneas de células T se clonaron a partir de células individuales que expresaban los marcadores de células T CD3 y CD4/CD8. Los inventores han mostrado que algunos de estos clones de células T 2 ES 2 366 176 T3 producen de manera constitutiva altos niveles de interferón que tienen las propiedades de IFN- tal como se determina mediante la capacidad de sus sobrenadantes para prevenir la lisis mediada por virus de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF), la labilidad de la actividad de IFN al calor y pH bajo y la capacidad de estos sobrenadantes para inducir la producción de nitrito por macrófagos de pollo. Los inventores han generado una biblioteca de ADNc a partir de una de las líneas de células T clonadas que producen una actividad de interferón- y han aislado y secuenciado satisfactoriamente una molécula de ácido nucleico que codifica para, o es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica para IFN- aviar (a continuación en el presente documento denominada ChIFN-). se han producido y expresado constructos genéticos recombinantes que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención en células transformadas y se han producido moléculas inmunorreactivas, en particular anticuerpos monoclonales y policlonales, frente al polipéptido de IFN- recombinante producido a partir de los mismos. Sorprendentemente, el IDN-y de la presente invención posee muchas características útiles, incluyendo la capacidad para promover el crecimiento de una especie aviar o para prevenir la pérdida de peso durante infecciones patógenas cuando se administra a la misma por cualquier medio, además de la capacidad de actuar como molécula inmunomoduladora a través de los límites de especie. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: (i) una secuencia que codifica para un interferón- aviar que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o al menos el 40% idéntica a la misma a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1; o (ii) una secuencia que es complementaria a la secuencia de (i). El término aviar significa un miembro de la clase de vertebrados denominados comúnmente aves. Tal como se usa en el presente documento, el término aviar incluye ambos sexos y todos los estadios de desarrollo de las especies de aves de corral, aves domésticas y aves de caza seleccionadas de la lista que comprende pollos, pavos, gallinas de Bantam, codornices, gallinas de Guinea, patos, gansos, avestruces, emús, palomas, canarios, periquitos, loros y pinzones, entre otros. A continuación en el presente documento, la expresión polipéptido de citocina se refiere a una molécula de polipéptido que comprende al menos una subunidad de una proteína biológicamente activa que posee una o más de las características biológicas características de una citocina, en particular la capacidad para afectar a las funciones de una célula que funciona en el sistema inmunitario de un animal. A continuación en el presente documento, la expresión polipéptido de interferón tipo II se refiere a un polipéptido de citocina tal como se define anteriormente en el presente documento en el que dicha citocina posee al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, incluso más preferiblemente al menos cuatro, todavía incluso más preferiblemente al menos cinco y lo más preferiblemente seis de las siguientes propiedades características: (i) Puede prevenir la lisis mediada por virus de una célula aviar tal como, pero sin limitarse a una célula de fibroblasto embrionario de pollo o una célula de fibroblasto embrionario de pavo; (ii) es sensible al tratamiento que comprende temperatura alta, preferiblemente temperaturas de al menos 50ºC, más preferiblemente al menos 60ºC; (iii) es sensible a la exposición a pH bajo, preferiblemente... [Seguir leyendo]

(i) una secuencia que codifica para un interferón aviar que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o al menos el 40% idéntica a la misma a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1; o (ii) una secuencia que es complementaria a la secuencia de (i). 2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la identidad en porcentaje objeto es al menos el 55% idéntica a la misma a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1. 3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, en la que la identidad en porcentaje objeto es al menos el 65% idéntica a la misma a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1. 4. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica para o es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de interferón aviar, pudiendo hibridarse dicha molécula de ácido nucleico en condiciones de rigurosidad al menos baja con la molécula de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1 o una hebra complementaria de la misma; y comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos que es al menos el 40% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1. 5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4, que comprende además una secuencia de nucleótidos que es al menos el 55% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1. 6. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4, que comprende además una secuencia de nucleótidos que es al menos el 65% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1. 7. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4 ó 5 ó 6, en la que dicho IFN es una molécula de interferón de pollo. 8. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en longitud aislados de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1. 9. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos en longitud derivados de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1. 10. Constructo genético que incluye la molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 operativamente unida a una secuencia promotora. 11. Constructo genético según la reivindicación 10, adecuado para su expresión en una célula procariota incluyendo pero sin limitarse a bacterias. 12. Constructo genético según la reivindicación 11, denominado pQE interferón de pollo y depositado con el número de registro de AGAL N96/9464. 13. Constructo genético según la reivindicación 10, adecuado para su expresión en una célula eucariota. 14. Constructo genético según la reivindicación 13, denominado pcDNA3/G-IFN aviar y depositada en AGAL como número de registro N95/12388. 15. Constructo genético que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para o es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de citocina aviar en el que dicho polipéptido es un polipéptido de fusión entre: (i) interferón aviar y un segundo interferón tipo II; o ES 2 366 176 T3 (ii) interferón aviar y un interferón tipo I seleccionados de la lista que comprende interferón, interferón, interferón de pollo o interferón de pollo 36 ES 2 366 176 T3 en el que dicho interferón aviar comprende una secuencia de residuos de aminoácido tal como se expone en SEQ ID NO: 2 o es al menos el 40% idéntica a la misma a lo largo de la longitud de SEQ ID NO: 2. 16. Constructo genético según la reivindicación 15, en el que dicho interferón aviar es una molécula de interferón de pollo. 5 17. Polipéptido de interferón aviar recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o es al menos el 40% idéntica a la misma a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 2. 18. Polipéptido de citocina aviar recombinante según la reivindicación 16, en el que dicho interferón aviar es interferón de pollo. 10 19. Método de producción de una citocina aviar recombinante en una célula que comprende expresar en dicha célula en cultivo una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 20. Método de producción de un interferón aviar recombinante en una célula en cultivo que comprende las etapas de: (i) introducir en dicha célula un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16; y 15 (ii) cultivar dicha célula durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dicha molécula de ácido nucleico se exprese. 21. Método según la reivindicación 20, que comprende además la etapa de aislar dicho interferón aviar. 22. Célula aislada que expresa un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18. 23. Célula aislada según la reivindicación 22, en la que dicho interferón aviar es interferón de pollo. 20 24. Célula aislada según la reivindicación 23, en la que dicho interferón de pollo comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 2, o es al menos el 40% idéntica a la misma a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 2. 25. Célula aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, siendo dicha célula una célula eucariota. 26. Célula aislada según la reivindicación 25, en la que dicha célula eucariota es una célula aviar. 25 27. Célula aislada según la reivindicación 26, en la que dicha célula aviar es una célula T. 28. Célula aislada según la reivindicación 27, en la que dicha célula T es la línea celular CC8.1h depositada como número de registro de AGAL N94/46035. 29. Célula aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en la que el interferón aviar es una molécula recombinante y la célula eucariota es una célula de mamífero, levadura, insecto o vegetal o una línea 30 celular seleccionada de la lista que comprende células COS, VERO, HeLa, C127 de ratón, de ovario de hámster chino (CHO), WI-38, de riñón de cría de hámster (BHK) o MDCK. 30. Célula aislada según la reivindicación 29, siendo dicha célula la línea celular COS que contiene el plásmido pCDNA3/G-IFN aviar depositado como número de registro de AGAL N95/12388. 31. Célula aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, siendo dicha célula una célula procariota y 35 siendo la citocina una molécula recombinante. 32. Célula aislada según la reivindicación 31, siendo la célula una bacteria. 33. Cepa de Escherichia coli pQE ChIFN depositada como número de registro de AGAL N96/9464. 34. Célula aislada que contiene la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 35. Célula aislada que contiene el constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16. 37 ES 2 366 176 T3 36. Uso del polipéptido de interferón aviar recombinante según la reivindicación 17 ó 18 en la fabricación de un medicamento para el mantenimiento, la estimulación o la potenciación de una respuesta inmunitaria en un animal aviar. 37. Uso de la molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la 5 fabricación de un medicamento para el mantenimiento, la estimulación o la potenciación de una respuesta inmunitaria en un animal aviar. 38. Uso del constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 en la fabricación de un medicamento para el mantenimiento, la estimulación o la potenciación de una respuesta inmunitaria en un animal aviar. 10 39. Uso de un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18 o un polipéptido de fusión entre un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18 y un segundo interferón tipo II seleccionado de la lista que comprende interferón, interferón, interferón de pollo e interferón de pollo en la fabricación de un medicamento para el mantenimiento, la estimulación o la potenciación de una respuesta inmunitaria en un animal aviar. 40. Uso de a polipéptido de interferón aviar recombinante según la reivindicación 17 ó 18, una molécula de ácido 15 nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 o un polipéptido de fusión entre un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18 y un segundo interferón tipo II seleccionado de interferón, interferón, interferón de pollo e interferón de pollo en la fabricación de un medicamento para el mantenimiento, la estimulación o la potenciación de una respuesta inmunitaria en un animal aviar, en el que el animal aviar es susceptible de infección o está infectado por un agente 20 infeccioso viral seleccionado de la lista que comprende virus de la bronquitis infecciosa, virus de la laringotraqueitis infecciosa aviar, virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus de la anemia del pollo y virus de la gripe aviar o un procariota seleccionado de E. coli, Salmonella ssp., Eimeria ssp. o Mycoplasma ssp. 41. Uso según la reivindicación 40, en el que dicho medicamento está en una forma adecuada para su 25 administración al animal aviar mediante ingestión o mediante inyección in ovo, inyección tras la eclosión, inyección intraperitoneal, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección intraocular, inyección intravenosa o inyección subcutánea. 42. Adyuvante que comprende una molécula de citocina aviar, en el que dicha citocina es un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18 o una molécula de fusión entre dicha molécula de interferón aviar según la 30 reivindicación 17 ó 18 y una segunda molécula de citocina y, opcionalmente, un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. 43. Adyuvante según la reivindicación 42, en el que el interferónes interferón de pollo. 44. Adyuvante según la reivindicación 42 ó 43, en el que si la citocina es una molécula de fusión la segunda molécula de citocina es un interferón tipo I incluyendo interferón, interferón, interferón de pollo o interferón 35 de pollo o cualquier molécula de interferón tipo II. 45. Adyuvante que comprende al menos la citocina aviar recombinante según la reivindicación 17 ó 18 en combinación con un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. 46. Composición de vacuna que comprende el adyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45 en combinación con un antígeno tal como un organismo patógeno infeccioso vivo, un organismo patógeno muerto, una 40 vacuna recombinante o una vacuna de subunidades recombinante derivada de la misma y, opcionalmente, uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables, aceptables para uso veterinario. 47. Composición de vacuna según la reivindicación 46, en la que el antígeno se deriva de un patógeno viral o bacteriano u otro seleccionado de la lista que comprende virus de la bursitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa aviar, virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad 45 de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus de la anemia del pollo, virus de la gripe aviar, E. coli, Salmonella ssp. o Eimeria ssp. 48. Uso del polipéptido de interferon aviar recombinante según la reivindicación 17 ó 18 en la fabricación de una sustancia que puede estimular el rendimiento de crecimiento de un animal aviar. 49. Uso de la molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la 38 ES 2 366 176 T3 fabricación de una sustancia que puede estimular el rendimiento de crecimiento de un animal aviar. 50. Uso del constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 en la fabricación de una sustancia que puede estimular el rendimiento de crecimiento de un animal aviar. 51. Uso de un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18 o un polipéptido de fusión entre un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18 y o bien un segundo interferón tipo II o bien un interferón tipo I seleccionados de la lista que comprende interferón, interferón, interferón de pollo e interferón de pollo en la fabricación de una sustancia que puede estimular el rendimiento de crecimiento de un animal aviar. 52. Molécula de anticuerpo que puede unirse a un interferón aviar o al interferón aviar recombinante según la reivindicación 17 ó 18. 53. Producto alimenticio terapéutico o medicamentoso que comprende el polipéptido de interferón aviar recombinante según la reivindicación 17 ó 18 en una forma adecuada para su ingestión por una especie de ave de corral, ave doméstica o ave de caza. 54. Uso del anticuerpo según la reivindicación 52 para someter a ensayo la cantidad de interferón aviar en una muestra biológica derivada de una especie de ave. 55. Uso según la reivindicación 54, en el que el ensayo se usa para la selección de los acervos genéticos de aves que expresan o que puede inducirse que expresen altos niveles de un interferón aviar. 56. Uso según la reivindicación 55, en el que el ensayo se usa para la selección de un acervo genético seleccionado de aves que presentan adicionalmente una resistencia a enfermedades mejorada. 57. Uso según la reivindicación 56, en el que la resistencia a enfermedades es un patógeno viral, bacteriano u otro seleccionado de la lista que comprende virus de la bursitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa aviar, virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus de la anemia del pollo, virus de la gripe aviar, E. coli, Salmonella ssp. o Eimeria ssp. 58. Uso según la reivindicación 54, en el que el ensayo es para determinar la magnitud de una respuesta inmunitaria en un ave. 59. Uso del anticuerpo según la reivindicación 52 en el aislamiento o la purificación de un interferón aviar. 60. Ensayo de diagnóstico para medir el nivel de un interferón aviar según la reivindicación 17 ó 18 en un ave que comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica obtenida de dicha ave con el anticuerpo según la reivindicación 52 durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de un complejo anticuerpo-citocina y luego detectar dicha formación de complejo. 61. Uso del ensayo de diagnóstico según la reivindicación 60 para seleccionar acervos genéticos de aves que expresan altos niveles de una citocina aviar. 62. Uso del ensayo de diagnóstico según la reivindicación 60, para determinar la presencia de o para cuantificar la magnitud de una respuesta inmunitaria en una especie de ave. 63. Uso según la reivindicación 62, en el que la respuesta inmunitaria es frente a un patógeno viral, bacteriano u otro seleccionado de la lista que comprende virus de la bursitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa aviar, virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus de la anemia del pollo, virus de la gripe aviar, E. coli, Salmonella ssp. o Eimeria ssp. 64. Uso del ensayo de diagnóstico según la reivindicación 60 para medir el nivel de inmunidad mediada por células tras la vacunación de un ave con un antígeno. 39 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 41 ES 2 366 176 T3 42 ES 2 366 176 T3 43 ES 2 366 176 T3 44 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 46 ES 2 366 176 T3 47 ES 2 366 176 T3 48 ES 2 366 176 T3 49 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 51 ES 2 366 176 T3 52 ES 2 366 176 T3 53 ES 2 366 176 T3 54 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 56 ES 2 366 176 T3 57 ES 2 366 176 T3 58 ES 2 366 176 T3 59 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 61 ES 2 366 176 T3 62 ES 2 366 176 T3 63 ES 2 366 176 T3 64 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 66 ES 2 366 176 T3 67 ES 2 366 176 T3 68 ES 2 366 176 T3 69 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 71 ES 2 366 176 T3 72 ES 2 366 176 T3 73 ES 2 366 176 T3 74 ES 2 366 176 T3 ES 2 366 176 T3 76 ES 2 366 176 T3 77 ES 2 366 176 T3 78