ANIMAL TRANSGÉNICO Y PROCEDIMIENTO DE CRIBADO DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS.

Animal transgénico o quimérico y procedimiento de cribado de productos farmacéuticos. La invención describe un procedimiento de sustitución específica de una copia de un gen presente en el genoma de un organismo eucariota receptor que no es un embrión humano mediante la integración de un gen diferente del gen inactivado. Preferentemente, el gen receptor estará presente en por lo menos 2 ejemplares en la célula huésped transfectada. El gen receptor se define como el gen en el que se realizará la inserción de un gen diferente. Más particularmente, la invención se refiere a la producción de animales transgénicos no humanos en los cuales el gen extraño se ha introducido de forma localizada para permitir a la vez el mantenimiento de las funciones genéticas normales del animal y la expresión del gen extraño bajo el control de promotores endógenos. Por "gen diferente o extraño" se entiende cualquier secuencia nucleotídica que corresponda a la totalidad o a una parte de un gen "extraño o diferente" del gen receptor, tal como se encuentre normalmente en el genoma (ARN o ADN), o corresponde igualmente a una secuencia modificada artificialmente del gen normal o incluso a un fragmento de dicha secuencia. La invención se refiere igualmente al procedimiento de producción de estos animales transgénicos no humanos. En la producción de animales transgénicos, los métodos convencionales utilizados para la introducción de secuencias de ADN heterólogas en la progenie celular germinal, no permiten controlar el sitio de integración del gen extraño en el genoma, ni el número de copias introducido de esta forma. La integración del gen extraño se hace al azar y, en general, varias copias del gen se integran a la vez, a veces en forma de tándem cabeza-cola, variando de un animal transgénico a otro el sitio de integración y el número de copias integradas. Puede, por lo tanto, darse el caso de que genes celulares endógenos, situados en el punto de inserción se inactiven de esta manera, sin que esto se detecte fácilmente debido a las numerosas inserciones al azar. Si el producto de dichos genes es importante para el desarrollo del animal, éste se alterará de forma importante. Por otra parte, la inserción aleatoria del gen extraño puede realizarse en un sitio que no sea apropiado para la expresión del gen. Además, el hecho de que varíe el sitio y el número de inserciones de animal en animal, hace que la interpretación de los estudios de expresión resulte extremadamente difícil. Un problema importante que se presenta en la producción de animales transgénicos es la obtención de la expresión del gen extraño. De forma general, se han llevado a cabo dos tipos de experimentos en los ratones. Los genes introducidos en la progenie germinal son: - bien genes "completos", que comprenden secuencias codificadoras flanqueadas por sus propias secuencias reguladoras; - bien genes compuestos, formados por la secuencia codificadora de un gen fusionada con la secuencia promotora de otro gen, perteneciendo incluso los dos fragmentos a veces a dos especies animales distintas. Se ha podido de esta forma confirmar que la especificidad de la expresión de los genes en tal o cual tejido está determinada por su(s) secuencias(s) reguladora(s). La elección del promotor apropiado para la expresión del gen extraño en el animal transgénico posee, pues, una importancia primordial. Por otra parte, la mutagénesis dirigida de genes murinos en células de origen embrionario se ha llevado a cabo recientemente apelando a una técnica de "administración genética dirigida" (gene targeting) (Thomas et al., 1987; Thompson et al., 1989). En el primer caso, el gen murino HPRT ha sufrido una mutación mediante inserción y reemplazamiento y, en el segundo caso, un gen HPRT mutado se ha corregido. Thomson et al han ampliado sus experiencias hasta la obtención de ratones quiméricos y han constatado el paso de la modificación genética a la progenie celular germinal. En cada uno de los documentos citados, el sitio preciso de la integración se ha realizado de forma dirigida mediante recombinación homóloga entre, por una parte, las secuencias exógenas que incluyen la mutación o corrección incluidas en un vector bajo el control de un promotor exógeno, y, por otra parte, su homólogo genómico. Siendo así, es preciso subrayar que los autores anteriores han llevado a cabo sus experimentos en un gen específico (HPRT), cuya activación mediante mutación se acompañaba de un fenotipo detectable. La mutación dirigida descrita por Thomas et al. tenía como efecto inactivar el gen HPRT y, en consecuencia, hacer desaparecer el fenotipo detectable normalmente asociado con el HPRT. El gen de selección Neo®, bajo el control de un promotor TK, se incorporaba por lo tanto al ADN de inserción para permitir la selección de los transformantes. Hay que señalar que los experimentos descritos en la técnica anterior implicaban una selección, bien por el gen receptor (por ejemplo HPRT), bien por el gen de inserción (por ejemplo, Neo®). El sitio de inserción y/o el tipo de gen insertado está pues limitado a los genes que confieren un carácter seleccionable, una selección directa. 2   Además, en la técnica anterior, las secuencias exógenas en el vector sirven pues a la vez para dirigir el sitio de integración y para introducir la modificación. Tras la recombinación homóloga, el gen modificado se encuentra siempre en su ambiente genético normal. Recordemos que un problema que se plantea durante la producción de animales transgénicos es el peligro de inactivar un gen celular endógeno que se encuentre en el punto de inserción del gen extraño. Según la función del producto del gen inactivado, tal inactivación puede conducir a alteraciones fisiológicas o morfológicas importantes en el animal transgénico, o bien podría incluso impedir su supervivencia. En cambio, la inactivación de un gen podría considerarse como ventajosa si el gen en cuestión codificara un receptor vírico u otro agente infeccioso. Los inventores han estudiado la posibilidad de evitar los inconvenientes descritos anteriormente y asociados, en ciertos casos, a la posible inactivación de uno o varios genes celulares endógenos de función importante durante la producción de animales transgénicos. La invención se refiere a un plásmido apto para efectuar la inserción dirigida de un ADN, denominado ADN de inserción, en el genoma de una célula eucariota, caracterizado porque contiene - una inserción que comprende ella misma el ADN de inserción y dos secuencias denominadas "flanqueadoras", a uno y otro lado del ADN de inserción, homólogas respectivamente a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en un gen receptor de la célula eucariota, - estando el ADN de inserción constituido por una parte de un gen susceptible de volverse funcional, o cuyo funcionamiento pueda volverse más eficaz, cuando se recombina con un ADN de complemento en el gen receptor para proporcionar entonces un gen recombinante completo en el genoma de una célula eucariota, - siendo el ADN de inserción heterólogo respecto al gen receptor, y - siendo las secuencias flanqueadoras seleccionadas de entre aquéllas que constituyen el ADN de complemento al que se ha aludido anteriormente, y que permiten, mediante recombinación homóloga con secuencias correspondientes del gen receptor, la reconstitución de un gen recombinante completo en el genoma de la célula eucariota, a condición de que cuando el ADN de inserción está constituido por una secuencia codificadora heteróloga desprovista de promotor, la secuencia codificadora es diferente de una secuencia que codifica para un agente de selección, comprendiendo la inserción asimismo entre una u otra de las secuencias flanqueadoras y dicho ADN de inserción, unas secuencias que permiten la selección de los transformantes. Según la invención, dicho ADN de inserción puede contener o bien una secuencia codificadora, o bien una secuencia reguladora. Por ejemplo, el ADN de inserción puede contener una secuencia codificadora desprovista de elemento de regulación, en particular de un promotor que le es propio. La invención se refiere asimismo a un animal transgénico o quimérico no humano susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento que comprende: - la transfección de células E.S. no humanas por el plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, - la selección para el acontecimiento de recombinación homóloga, - la inyección de las células seleccionadas en unos embriones no humanos en un estadio en el que son aptos pata integrar las células transfectadas, por ejemplo en el estadio blastocisto, - la reimplantación de las células en una madre portadora y, - el apareamiento de los individuos quiméricos obtenidos al término de la gestación y en los cuales se ha... [Seguir leyendo]

1. Plásmido apto para efectuar la inserción dirigida de un ADN, denominado ADN de inserción, en el genoma de una célula eucariota, caracterizado porque contiene: - una inserción que comprende ella misma el ADN de inserción y dos secuencias denominadas "flanqueadoras", a uno y otro lado del ADN de inserción, homólogas respectivamente a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en un gen receptor de la célula eucariota, - estando el ADN de inserción constituido por una parte de un gen susceptible de volverse funcional, o cuyo funcionamiento pueda volverse más eficaz, cuando se recombina con un ADN de complemento en el gen receptor para proporcionar entonces un gen recombinante completo en el genoma de una célula eucariota, - siendo el ADN de inserción heterólogo respecto al gen receptor, y - siendo las secuencias flanqueadoras seleccionadas de entre aquéllas que constituyen dicho ADN de complemento, y que permiten, mediante recombinación homóloga con secuencias correspondientes del gen receptor, la reconstitución de un gen recombinante completo en el genoma de la célula eucariota, a condición de que cuando el ADN de inserción está constituido por una secuencia codificadora heteróloga desprovista de promotor, la secuencia codificadora es diferente de una secuencia que codifica para un agente de selección, comprendiendo la inserción asimismo entre una u otra de las secuencias flanqueadoras y dicho ADN de inserción, unas secuencias que permiten la selección de los transformantes. 2. Plásmido apto para efectuar la inserción dirigida de un ADN, denominado ADN de inserción, en el genoma de una célula eucariota, caracterizado porque contiene: - una inserción que comprende ella misma el ADN de inserción y dos secuencias denominadas "flanqueadoras", a uno y otro lado del ADN de inserción, homólogas respectivamente a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en un gen receptor de la célula eucariota, - estando el ADN de inserción constituido por una parte de un gen susceptible de volverse funcional, o cuyo funcionamiento pueda volverse más eficaz, cuando se recombina con un ADN de complemento en el gen receptor para proporcionar entonces un gen recombinante completo en el genoma de una célula eucariota, - siendo el ADN de inserción heterólogo respecto al gen receptor, y conteniendo una secuencia reguladora que permite la expresión de una secuencia codificadora del gen receptor bajo el control de secuencias reguladoras del ADN de inserción; - siendo las secuencias flanqueadoras seleccionadas de entre aquéllas que constituyen dicho ADN de complemento, y que permiten, mediante recombinación homóloga con secuencias correspondientes del gen receptor, la reconstitución de un gen recombinante completo en el genoma de la célula eucariota, comprendiendo la inserción asimismo entre una u otra de las secuencias flanqueadoras y dicho ADN de inserción, unas secuencias que permiten la selección de los transformantes. 3. Plásmido según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las secuencias que permiten la selección de los transformantes comprenden una secuencia que codifica para un agente selectivo y un promotor que permite la expresión del agente selectivo. 4. Plásmido según la reivindicación 1 ó 2 que es el plásmido pGN tal como el ilustrado en la figura 1. 5. Célula eucariota transformada por el plásmido según la reivindicación 1 ó 2, no siendo dicha célula ni una célula germinal humana, ni una célula embrionaria humana. 6. Célula según la reivindicación 5, caracterizada porque se trata de una célula cepa embrionaria no humana. 7. Animal transgénico o quimérico no humano susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento que comprende: - la transfección de células E.S. no humanas por el plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, - la selección para el acontecimiento de recombinación homóloga, - la inyección de las células seleccionadas en unos embriones no humanos en un estadio en el que son aptos para integrar las células transfectadas, por ejemplo en el estadio blastocisto, - la reimplantación de las células en una madre portadora y,   - el apareamiento de los individuos quiméricos obtenidos al término de la gestación y en los cuales se ha constatado la colonización por las células E.S no humanas de la progenie germinal comprendiendo dicho animal unas células cuyo genoma comprende el ADN de inserción heteróloga, posicionado en el gen receptor endógeno y que comprende el ADN de complemento, de manera que el ADN de inserción y el ADN de complemento juntos proporcionan el gen recombinante completo. 8. Animal según la reivindicación 7, caracterizado porque el ADN de inserción contiene o bien una secuencia codificadora, cuya expresión tiene lugar bajo el control de las secuencias reguladoras del gen receptor, o bien una secuencia reguladora que permite la expresión de una secuencia codificadora del gen receptor. 9. Animal según la reivindicación 8, caracterizado porque el ADN de inserción contiene una secuencia codificadora desprovista de elemento de regulación, en particular de un promotor que le es propio. 10. Animal según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el gen receptor está inactivado a consecuencia de la inserción del ADN de inserción, sustituyendo la expresión del ADN de inserción a la del gen receptor. 11. Animal según la reivindicación 10, caracterizado porque la expresión del ADN de inserción sustituye completamente la expresión del gen receptor, evitando así la formación de proteínas de fusión. 12. Animal según la reivindicación 7, caracterizado porque el ADN de inserción contiene una secuencia reguladora que permite la expresión de una secuencia codificadora del gen receptor. 13. Animal según la reivindicación 7, caracterizado porque el gen receptor es un gen que normalmente no está transcrito en la célula. 14. Animal según la reivindicación 7, caracterizado porque el ADN de inserción es heterólogo para la especie transfectada. 15. Animal según la reivindicación 7, caracterizado porque el ADN de inserción sustituye una parte del gen receptor. 16. Animal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ADN de inserción está constituido por un fragmento de un gen relacionado con una patología. 17. Procedimiento para estudiar la actividad de productos farmacéuticos que se presume tienen una actividad respecto a los productos de expresión de un gen patológico relacionado con una enfermedad, caracterizado porque se administra el producto a un animal transgénico según la reivindicación 16. 16   17   18   19     21   22   23   24     26   27   28