Método de fijación de una secuencia de recuento para una muestra de ácido nucleico.

Un método de procesamiento de una muestra de ácido nucleico, que comprende:

(a) hibridar una población de cebadores directos (10) de la fórmula 5'-A-Y-Z con una población de moléculas de ácido nucleico molde (12), donde:

(i) la región A proporciona un sitio de unión a cebador cuando se copia por una polimerasa y es la misma en todos los cebadores de la población de cebadores directos;

(ii) la región Y varía entre los diferentes cebadores de la población de cebadores y proporciona una secuencia de recuento; y

(iii) la región Z es complementaria a un primer sitio en un polinucleótido diana en una población de moléculas de ácido nucleico molde y es la misma en todos los cebadores de dicha población de cebadores; y

dicha hibridación se realiza en presencia de

i) un segundo cebador (14) que comprende la secuencia de la región A;

ii) un tercer cebador (18) que tiene la secuencia B; y

iii) un cebador inverso (16) de fórmula 5'-B-W, donde la región B es una cola 5' de la secuencia B y la secuencia W es complementaria a un sitio en dicho polinucleótido diana;

donde el segundo y tercer cebadores están protegidos de la degradación por una exonucleasa 3' a 5';

(b) extender i) los cebadores directos que se hibridan con dicho polinucleótido diana en las etapas (a) e ii) el cebador inverso, utilizando una polimerasa termoestable que tiene una actividad de exonucleasa 3' a 5' que degrada los cebadores libres, utilizando dicho polinucleótido diana como molde para producir una población de primeros productos de extensión (22) que comprenden un sitio de unión (24) para dicho cebador inverso;

(c) hibridar dicho cebador inverso con el sitio de unión para dicho cebador inverso en la población de primeros productos de extensión producidos por la etapa (b);

(d) extender dicho cebador inverso para producir una población de segundos productos de extensión (28) que comprende el complemento de la región A y el complemento de la región Y, donde el complemento de la región Y es diferente en cada molécula en dicha población de segundos productos de extensión ;

(e) desactivar selectivamente, después de la etapa (d) cualquier cebador directo que no esté extendido, y

(f) amplificar dicha población de segundos productos de extensión mediante PCR utilizando: i) dicho segundo cebador que comprende la región A y ii) dicho tercer cebador que tiene la secuencia B, para producir una población de productos de PCR (30) en la que los productos clonalmente relacionados se marcan con la misma secuencia de recuento y los productos que no están relacionados clonalmente se marcan con una secuencia diferente entre sí; donde dichas etapas (a) a (f) se realizan en un recipiente cerrado y no se añaden reactivos adicionales al recipiente durante dicho método.