Ensayos mediados por proximidad para detectar proteínas de fusión oncogénicas.

Un método para determinar el nivel o estado de activación de una proteína de fusión oncogénica,

método que comprende:

(a) producir un extracto celular que comprende un extracto de células aisladas a partir de una muestra, en el que las células aisladas no se lavan antes de la lisis para producir el extracto celular;

(b) poner en contacto un extracto celular con un primer resto de unión específico para un primer dominio de una primera proteína de longitud completa en condiciones adecuadas para transformar la primera proteína de longitud completa presente en el extracto celular en un complejo que comprende la primera proteína de longitud completa y el primer resto de unión, en el que el primer dominio de la primera proteína de longitud completa está ausente de una proteína de fusión oncogénica correspondiente que comprende un segundo dominio, diferente de la primera proteína de longitud completa fusionado a un primer dominio de una segunda proteína de longitud completa diferente;

(c) retirar el complejo de la etapa (b) del extracto celular para formar un extracto celular desprovisto de la primera proteína de longitud completa;

(d) poner en contacto el extracto celular de la etapa (c) con un segundo resto de unión, un tercer resto de unión y un cuarto resto de unión en condiciones adecuadas para transformar la proteína de fusión oncogénica presente en el extracto celular en un complejo que comprende la proteína de fusión oncogénica y el segundo, tercer y cuarto restos de unión;

en el que el segundo resto de unión es específico para el segundo dominio, diferente de la primera proteína de longitud completa,

en el que el segundo resto de unión está sujeto en un soporte sólido en una matriz direccionable,

en el que el tercer resto de unión está etiquetado con una glucosa oxidasa y es específico para uno de los siguientes: (i) el primer dominio de la segunda proteína de longitud completa diferente; (ii) el segundo dominio, diferente de la primera proteína de longitud completa; o (iii) el sitio de fusión entre el segundo dominio, diferente de la primera proteína de longitud completa y el primer dominio de la segunda proteína de longitud completa diferente,

en el que el cuarto resto de unión está etiquetado con un primer miembro de un par de amplificación de señales y es específico para el primer dominio de la segunda proteína de longitud completa diferente, y

en el que la glucosa oxidasa genera un agente oxidante que se canaliza y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señales;

(e) incubar el complejo de la etapa (d) con un segundo miembro del par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y

(f) detectar la señal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificación de señales, determinando de ese modo el nivel o estado de activación de la proteína de fusión oncogénica.