Variante de virus de la hepatitis B (VHB).

Una variante de un virus VHB aislado, en el que la variante comprende una mutación en la ADN polimerasa seleccionada de N/S/H584K,

K587R y R588K con referencia a la numeración usada en la Figura 2, en el que dicha variante muestra sensibilidad reducida a un análogo de nucleósido.

Variante de virus de la hepatitis B (VHB)

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a variantes virales que muestran sensibilidad reducida a agentes particulares y/o capacidad de interacción reducida con reactivos inmunológicos. Más particularmente, la presente invención se refiere a variantes del virus de la hepatitis B que muestran resistencia completa o parcial a análogos de nucleósidos y/o capacidad de interacción reducida con anticuerpos para componentes de la superficie viral incluyendo sensibilidad reducida. La presente invención contempla además ensayos para detectar dichas variantes virales siendo dichos ensayos útiles en el control de los regímenes terapéuticos antivirales y el desarrollo de vacunas nuevas o modificadas dirigidas contra agentes virales y en particular variantes del virus de la hepatitis B.

Antecedentes de la invención

Se recogen al final de la descripción detalles bibliográficos de las publicaciones indicadas numéricamente en la presente memoria descriptiva.

Las mutaciones específicas en una secuencia de aminoácidos se representan en el presente documento como "XaainXaa2" en la que Xaai es el resto de aminoácido original antes de la mutación, n es el número de resto y Xaa2 es el aminoácido mutante. La abreviatura "Xaa" puede ser el código de tres letras o de una letra (es decir "X"). Los restos de aminoácidos para ADN polimerasa de virus de la Hepatitis B se numeran siendo el resto de metionina en el motivo Tyr Met Asp Asp (YMDD) el número de resto 550.

El virus de la Hepatitis B (VHB) puede provocar enfermedades debilitantes y puede conducir a suficiencia hepática aguda. El VHB es un virus de ADN que se replica mediante un intermedio de ARN y utiliza transcripción inversa en su estrategia de replicación (1). El genoma del VHB es de naturaleza compleja que tiene una estructura de ADN parcialmente bicatenario con fases abiertas de lectura solapantes que codifican genes de superficie, núcleo, polimerasa y X. La naturaleza compleja del genoma del VHB está representada en la Figura 1.

La presencia de una ADN polimerasa de VHB ha conducido a la propuesta de que los análogos de nucleósidos podrían actuar como agente antivirales eficaces. Son ejemplos de análogos de nucleósidos que se ensayan en la actualidad penciclovir y su forma oral famciclovir (2, 3, 4, 5), lamivudina (6,7). Se ha mostrado que adefovir tiene actividad anti VHB eficaz in vitro. En general, dichos análogos de nucleótidos se usan junto con terapia de inmunoglobulina de Hepatitis B (HBIG). Existe potencial para que dichos agentes se usen en el tratamiento de infección por VHB crónica.

Se ha mostrado que el penciclovir tiene actividad inhibidora potente contra la síntesis de ADN de VHB de pato in vitro y se ha mostrado que inhibe la actividad de ADN polimerasa-transcriptasa inversa de VHB in vitro (8, 9). De forma similar, se ha demostrado que el famciclovir oral inhibe la replicación interhepática de virus VHB de pato in vivo (10). En el hombre, se ha mostrado que el famciclovir reduce la replicación de ADN de VHB en un paciente con hepatitis B grave después de trasplante de hígado ortotópico (OLT) (11).

De Man et ai. (De Man R. A. et al. (1998) J. Hepatol. 29: 669-75) presenta un estudio sobre los acontecimientos clínicos, histológicos y virológicos en un receptor de trasplante de hígado ortotópico (OLT) con infección por hepatitis B recurrente. Pichoud et al. (Pichoud C. et al. (1999) Hepatology 29: 230-7) describe la selección transitoria de un mutante de gen de polimerasa de VHB que se asoció con la persistencia viral en un paciente inmunocompetente tratado con famciclovir. El documento WO 1999/066047 se refiere a una cepa viral de Hepatitis B inducida por vacuna y usos de la misma. El documento WO 2000/028009 se refiere a un virus de la Hepatitis B aislado con un componente de superficie que muestra un perfil inmunológico alterado en relación con un virus de la Hepatitis B de referencia. El documento WO 1998/021317 se refiere a variantes virales que muestran sensibilidad reducida a agentes particulares y/o capacidad de interacción reducida con reactivos inmunológicos. Bartholomeusz et al. (Bartholomeusz A. et al. (1997) Intervirology 40: 337-42) revisa el resultado del tratamiento con FCV en la prevención de VHB recurrente en pacientes después del trasplante.

En los trabajos que conducen a la presente invención, se usó terapia antiviral de análogos de nucleósidos para controlar la reaparición post OLT grave de infección por VHB (12). La terapia a largo plazo es obligatoria cuando los pacientes estén inmunosuprimidos y la tasa de replicación del VHB sea muy alta. Sin embargo, en dichas condiciones, como en cualquier quimioterapia a largo plazo de agentes infecciosos, existe el potencial de desarrollar resistencia o sensibilidad reducida a los agentes terapéuticos empleados. Además, algunos pacientes no responden al famciclovir pre-OLT. Esto puede deberse a que los pacientes no metabolizan famciclovir o que los pacientes están infectados con una variante de VHB resistente a famciclovir.

De acuerdo con la presente invención, los inventores han identificado variantes del VHB con mutaciones en el gen de la ADN polimerasa de VHB que en diversos grados reducen la sensibilidad del VHB a análogos de nucleósidos.

La identificación de estas variantes del VHB es importante para el desarrollo de ensayos para controlar los regímenes terapéuticos con análogos de nucleósidos y para explorar con respecto a agentes que pueden enmascarar los efectos de la mutación, es decir en el desarrollo de nuevas vacunas. Además, ya que el genoma de VHB comprende una serie de fases abiertas de lectura solapantes, una mutación de nucleótidos en una fase abierta de lectura puede afectar a productos de traducción en otra fase abierta de lectura. De acuerdo adicionalmente con la presente invención, los inventores han observado mutaciones que reducen la capacidad de interacción de reactivos inmunológicos, tales como anticuerpos y células inmunitarias, con componentes de superficie viral. Dichas variantes virales se denominan en el presente documento "mutantes de escape" ya que potencialmente escapan de la memoria ¡nmunológlca existente.

Sumarlo de la Invención

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento indicado o número entero o grupos de elementos o números enteros pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se denominan por un identificador de secuencia, es decir <400>1, <400>2, etc. Después de las reivindicaciones se proporciona un listado de secuencias.

En un aspecto, la presente invención proporciona una variante de un virus VHB aislado, en el que la variante comprende una mutación en la ADN polimerasa seleccionada de N/S/H584K, K587R y R588K en la que dicha vahante muestra sensibilidad reducida a un análogo de nucleósido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar el potencial para que un VHB muestre sensibilidad reducida a un análogo de nucleósido, comprendiendo dicho método aislar ADN o ARNm correspondiente de dicho VHB y explorar con respecto a una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica la ADN polimerasa dando como resultado al menos una sustitución, deleción y/o adición de aminoácidos en el dominio D de dicha ADN polimerasa en el que la presencia de dicha mutación es una indicación de la probabilidad de resistencia a dicho análogo de nucleósido, en el que el método determina una o más de las siguientes mutaciones en la ADN polimerasa: N584K, K587R y R588K.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una variante de un virus VHB aislado en el que la variante comprende una mutación en la ADN polimerasa seleccionada de N/S/H584K, K587R y R588K en el que dicha variante muestra sensibilidad reducida a un análogo de nucleósido en la exploración con respecto a un agente antiviral capaz de inhibir dicho virus.

Se describe en el presente documento una variante de un virus de ADN aislado que se replica mediante un intermedio de ARN en el que dicha vahante comprende una mutación de nucleótidos en un gen que codifica una ADN polimerasa dando como resultado al menos una adición, sustitución y/o deleción de aminoácidos en dicha ADN polimerasa.

También se describe una vahante de un virus de ADN aislado que se replica mediante un intermedio de ARN en el que dicha variante comprende una mutación de nucleótidos... [Seguir leyendo]

1. Una variante de un virus VHB aislado, en el que la variante comprende una mutación en la ADN polimerasa

seleccionada de N/S/H584K, K587R y R588K con referencia a la numeración usada en la Figura 2, en el que dicha

variante muestra sensibilidad reducida a un análogo de nucleósido.

2. Un método para determinar el potencial para que un VHB muestre sensibilidad reducida a un análogo de nucleósido, comprendiendo dicho método aislar ADN o ARNm correspondiente de dicho VHB y explorar con respecto a una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica la ADN polimerasa dando como resultado al

menos una sustitución, deleción y/o adición de aminoácidos en el dominio D de dicha ADN polimerasa en el que la presencia de dicha mutación es una indicación de la probabilidad de resistencia a dicho análogo de nucleósido, en el que el método determina una o más de las siguientes mutaciones en la ADN polimerasa: N584K, K587R y R588K con referencia a la numeración usada en la Figura 2.

3. Uso de una variante de un virus VHB aislado en el que la variante comprende una mutación en la ADN polimerasa

seleccionada de N/S/H584K, K587R y R588K con referencia a la numeración usada en la Figura 2, en el que dicha

variante muestra sensibilidad reducida a un análogo de nucleósido en la exploración con respecto a un agente antiviral capaz de inhibir dicho virus.