Uso de una molécula HSPC117 como ARN ligasa.

Una lámina multicapa (5) para moldeo por infusión bajo vacío que comprende un apilamiento de capas que es permeable al aire y controlable de tal modo que en un primer estado la transmisión de una resina líquida es bloqueada a través del apilamiento de capas y que en un segundo estado la resina líquida puede penetrar al menos parcialmente a través del apilamiento de capas,

en que el primer estado corresponde a una primera temperatura y el segundo estado corresponde a una segunda temperatura que es superior a la primera temperatura;

incluyendo el apilamiento de capas una capa intermedia (12) que tiene agujeros de perforación (22);

en el que los agujeros de perforación (22) están provistos de un diámetro que es bastante pequeño de modo que por debajo de la segunda temperatura, la resina líquida es impedida de penetrar a través de la capa intermedia;

en el que el apilamiento de capas incluye además una capa superior (10) que es capaz de absorber la resina líquida, una capa inferior (14) que es capaz de facilitar una liberación de la lámina multicapa (5), caracterizada por que la capa intermedia (12) tiene un punto de fusión que corresponde a la segunda temperatura, en que a la segunda temperatura el proceso de fusión de la capa intermedia (12) comienza alrededor de los agujeros de perforación causando que los agujeros de perforación se ensanchen y permitiendo la penetración de la resina líquida a través de la capa intermedia, y por que el apilamiento de capas incluye además una primera capa de adherencia (16) que conecta la capa superior (10) con la capa intermedia (12), y una segunda capa de adherencia (18) que conecta la capa intermedia (12) con la capa inferior (14).

Uso de una molécula HSPC117 como ARN ligasa

La presente invención se refiere al campo de las herramientas de biología celular y molecular, en particular al uso de ARN ligasas, y ARN ligasas para su uso en análisis y terapia.

Las enzimas naturales que ligan el ARN o el ADN generalmente unen una molécula de ácido nucleico que tiene un grupo fosforilo en la posición 5 con una segunda molécula de ácido nucleico que tiene un grupo hidroxilo en la posición 3. Normalmente el ATP proporciona el fosfato del extremo 5 en una etapa de transferencia de energía.

Los ARN de transferencia (ARNt) son moléculas adaptadoras esenciales para la traducción de ARN mensajero (ARNm) en proteínas. De manera similar a otras moléculas de ARN, los transcritos de ARNt precursor (pre-ARNt) se someten a amplio procesamiento postranscripcional antes de cumplir sus funciones biológicas. Además de la eliminación de secuencias líder 5 y de cola 3, de extensivas modificaciones de bases y azúcares y de la adición de nucleótidos independiente de molde, algunos ARNt tienen que someterse a escisión de una secuencia interviniente. La eliminación de intrones de ARNt se realiza mediante un proceso de corte y empalme que se diferencia del procesamiento canónigo dependiente de espliceosoma del ARNm. En su lugar el corte y empalme del ARNt requiere una endonucleasa especializada que escinda el intrón y una ligasa que una las mitades exónicas (Fig. 1 A).

El documento WO 24/87884 A2 describe procedimientos para explorar moléculas orgánicas pequeñas que intervienen en el procesamiento de ARNt. Pascal y col., Current Opinión in Structural Biology 18 (1) (28): 96-15, hacen referencia a diferencias en PNA y ARN ligasas. Kato y col., Journal of Molecular Biology 239 (5) (23): 93- 911, describen una estructura cristalina de una ARN ligasa de Thermus thermophilus. Wang y col., RNA 11 (6) (25): 966-975 realizaron un análisis funcional-estructural de ARNt ligasas de levadura. Okada y col., PROTEINS 63 (4) (26): 1119-1122, proporcionan una estructura cristalina de una proteína RtcB homologa de Pyrococcus horikoshii, una ARN ciclasa.

Aunque la presencia de intrones en genes de ARNt parece ser común en todos los dominios de la vida, la evolución de la maquinaria de corte y empalme ha divergido aparentemente en la etapa de ligamiento. Se han descrito dos rutas de ligamiento principales que pueden atribuirse a distintos reinos de la vida (Abelson y col., 1998). Los ciados de hongos y plantas usan un mecanismo de ligamiento común catalizado por polipéptidos multifuncionales sencillos que son homólogos a la ARN ligasa 1 del bacteriófago T4. Esta ruta requiere la acción de actividades fosfodiesterasa y polinucleótido quinasa cíclicas para preparar el extremo exónico para su ligamiento posterior. Como consecuencia, un fosfato exógeno que se origina a partir de un nucleósido trifosfato (NTP) donante se incorpora en el ARNt maduro (Fig. 1A, rama superior). Por otro lado, los ciados de animales y arqueas pueden ligar exones de ARNt uniendo directamente el fosfato 2,3-cíclico y el extremo 5-hidroxilo (5-OFI) que queda después de la reacción de endonucleasas (Laski y col., 1983). Esta reacción ligasa (Fig. 1A, rama inferior) es dependiente de ARN terminado en fosfato 2,3-cíclico (ARN>p) y da como resultado la incorporación del fosfato 2,3 cíclico derivado precursor en la unión de corte y empalme del ARNt maduro como un 3,5-fosfodiéster (Filipowicz y Shatkin, 1983). Se han esclarecido los aspectos bioquímicos clave de esta reacción ARN>p ligasa. Sin embargo, a pesar de los muchos esfuerzos bioquímicos, bioinformáticos y genéticos realizados, se han identificado ARN ligasas no adecuadas dado que inicialmente se postuló la ruta de corte y empalme del ARNt.

Es por tanto un objetivo de la presente invención proporcionar un uso de una ARN ligasa que sea al menos también capaz de usar como sustrato ARN terminado en fosfato 2, 3 cíclico ("ARN>p ligasa"). Este objetivo se consigue mediante la materia objeto de las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere al uso de una molécula FISPC117 como una ARN ligasa como una herramienta de biología molecular y en terapia. La FISPC117 se ha secuenciado (por ejemplo, Genbank ACC N°: NP_55121 o CAG33456), y localizado en la orf (fase de lectura abierta, del inglés open reading frame) 28 del cromosoma 22 ("C22RF28"). La molécula HSPC117 es el homólogo humano de la familia de genes de RtcB de bacterias/arqueas caracterizada por un dominio muy conservado de función desconocida (UPF27) y un pliegue de proteína único. Las proteínas UPF27 forman un grupo de genes ortólogos (KOG3833) sin representantes detectables en los organismos de modelos de plantas y hongos. Esta distribución filática recuerda mucho a la aparición exclusiva de la actividad ARN>p ligasa en animales y arqueas. La FISPC117 también se denomina en el presente documento HSPC117/C22RF28 o RtcB/FISPC117. Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de HSPC117" se refiere a cualquier molécula homologa u ortóloga en este grupo que se ha identificado ahora que cataliza una reacción ARN ligasa. En la Fig. 6 se proporcionan secuencias ejemplares de dichas "moléculas FISPC117" como SEC ID N°: 1 a SEC ID N°: 11. Se ha descubierto que todas las moléculas FISPC117 contienen el resto de cisteína catalítico correspondiente a C122 de la SEC ID N°: 1.

Adicionalmente, las moléculas y secuencias de FISPC117 se han descrito, por ejemplo, en el documento US 27/24352 A1 (especialmente SEC ID Nos: 15, 16, 69, 7, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78), sin embargo sin reconocimiento previo de los usos inventivos. El documento US 27/24352 A1 se refiere a una exploración de genes posiblemente implicados en la agregación de alfa-sinucleína. En el párrafo [5], el documento US 27/24352 A1 proporciona antecedentes sobre el grado notable de conservación evolutiva de genes de

HSPC117, cuyas proteínas pueden usarse en un procedimiento de la presente invención, en el conocimiento de una nueva función de estas moléculas de HSPC117.

En la presente invención la ARN ligasa puede usarse para catalizar la transferencia de un primer ARN a un segundo ARN. Los extremos de ambos ARN pueden conectarse a través de la ligasa. Esta conexión es normalmente una conexión covalente de un enlace fosfodiéster entre ambos ARN. En particular, un ARN puede comprender un fosfato 3, en particular en forma de un fosfato 2, 3 cíclico, y el otro puede comprender un OH-5 terminal. La capacidad para formar una conexión entre dichos extremos, en particular usando un OH-5 terminal, es una característica exclusiva de la molécula HSPC117 de la invención.

En general, el ligamiento de ARN puede ser un ligamiento Ínter- o intracatenario. Dos cadenas distintas de ARN pueden conectarse en el extremo 3 y 5, respectivamente. Además, en un ligamiento intracatenario, se conecta el extremo 5 y 3 de una molécula de ARN.

En una realización adicional de la presente invención el ARN es bicatenario. En particular, la primera y/o segunda molécula de ARN conectada por la ARN ligasa de la invención puede comprender una sección bicatenaria o puede ser completamente bicatenaria o como alternativa monocatenarla. En particular se prefiere que el extremo 3 mencionado anteriormente así como el 5 terminal del otro extremo del ARN, que están conectados por la reacción ARN ligasa, sean blcatenarlos. Otras partes del ARN también pueden ser monocatenarias, en particular del corte y empalme del ARN hay normalmente un saliente monocatenario 3 de un pre-ARNt. Además, los extremos 5 y/o 3, que están conectados por la reacción ARN ligasa pueden ser monocatenarlos-como es normalmente el caso en el procesamiento del pre-ARNt. La disposición de cadena doble pueden ser un emparejamiento de bases entre la primera y segunda moléculas de ARN, o como alternativa puede ser un emparejamiento de bases con cadenas de ARN adicionales.

En realizaciones particularmente preferidas la molécula HSPC117 de la presente invención se usa para el corte y empalme del ARN. En una reacción de corte y empalme del ARN se elimina una sección intrónica entre dos exones, que están conectados por la ARN ligasa. Una reacción de corte y empalme típica es la reacción de una secuencia exón 1-intrón-exón 2 en exón 1-exón 2. Otras reacciones de corte y empalme pueden eliminar diversos intrones y, opcionalmente, también exones entre estas secciones intrónicas.

El ARN que está conectado mediante el uso de la molécula HSPC117 de la Invención como una ARN ligasa, puede tener cualquier longitud. Son ejemplos de longitudes de ARN longitudes de 2 a 3 nucleótldos o pares de pares. En realizaciones especiales, el primer ARN o el segundo ARN puede tener... [Seguir leyendo]

1. El uso de una molécula HSPC117 como ARN llgasa, preferentemente para la transferencia de un primer extremo de ARN a un segundo extremo de ARN, en el que en particular se prefiere que el primer extremo comprenda un fosfato 3, preferentemente un fosfato 2,3-cíclico, y/o en el que el segundo extremo comprenda un 5-OH terminal.

2. El uso de la reivindicación 1 para un ligamiento Inter- o intra-catenarlo.

3. El uso de la reivindicación 1 o 2 en el que el ARN es bicatenarlo.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el corte y empalme del ARN.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el ARN es un ARNm o un ARNt.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el ARN tiene una longitud de 2 a 3 nucleótidos

o pares de bases.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la molécula HSPC117 es una cualquiera de SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3, SEC ID N°: 4, SEC ID N°: 5, SEC ID N°: 6, SEC ID N°: 7, SEC ID N°: 8, SEC ID N°: 9, SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 11, SEC ID N°: 13, SEC ID N°: 15, SEC ID N°: 17, SEC ID N°: 19, SEC ID N°: 21, SEC ID N°: 23.

8. El procedimiento de ligar al menos dos moléculas de ARN que comprende usar una molécula HSPC117 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende preferentemente poner en contacto las al menos dos moléculas de ARN con dicha molécula HSPC117 en una célula, o que comprende preferentemente poner en contacto las al menos dos moléculas de ARN con dicha molécula HSPC117 in vitro, que comprende adicionalmente en particular preferentemente proporcionar la molécula HSPC117 en un complejo, preferentemente con partículas espliceosomales, en el que preferentemente el complejo comprende una molécula helicasa DDX1 de caja DEAD, una molécula FAM98B, una molécula CGI-99, ASWo cualquier combinación de las mismas.

9. Un kit adecuado para realizar un ligamiento de ARN, que comprende una molécula HSPC117, un tampón de reacción de ARN ligasa que comprende componentes tampón y uno o más iones metálicos seleccionados de Mg2+, Mn2+, N¡2+ o mezclas de los mismos, para su uso en un intervalo de concentración final de aproximadamente ,1-2 mM, preferentemente 1-1 mM, en particular siendo preferido 2-5 mM, comprendiendo adicionalmente de manera opcional una molécula de ARN con fosfato 2,3-cíclico, preferentemente además con un marcador.

1. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la molécula HSPC117 se usa en una célula transgénica que comprende una molécula HSPC117 expresada de manera exógena, preferentemente con un promotor inducible.

11. Un procedimiento de reducción de una actividad ARN ligasa, en particular una actividad ARN>p ligasa, en una célula que comprende inhibir una molécula HSPC117 en una célula, preferentemente por inactivación génica o ARNi.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, caracterizado porque la inhibición es por reducción de la expresión de una molécula HSPC117, preferentemente una molécula HSPC117 endógena, en dicha célula.

13. El procedimiento de la reivindicación 11 o 12 para reducirla producción o el procesamiento del ARNt en dicha célula.

14. El uso de una célula transgénica que comprende una molécula HSPC117 expresada de manera exógena, preferentemente con un promotor inducible, para estudios de ligamiento o de corte y empalme del ARN, preferentemente para modular las cantidades de ARNti en una célula.

15. El uso de una célula con inactivación génica de HSPC117 o de una célula con expresión reducida o inhibida de HSPC117 endógena para estudios de ligamiento o de corte y empalme del ARN, preferentemente para modular las cantidades de ARNti en una célula, o para reducir la actividad ARN ligasa, en particular la actividad ARN>p ligasa, en la célula o para reducir la producción o el procesamiento del ARNti en dicha célula.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, 14 o 15, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero.

17. Un anticuerpo anti-HSPC117 o ARNip o ARNhp de HSPC117 para su uso en un procedimiento de reducción del crecimiento de células tumorales o de una enfermedad o infección dependiente de polimerasas del huésped, tal como infección por el virus de la hepatitis delta.

18. Una molécula HSPC117 para su uso en un sujeto en el tratamiento de una enfermedad que está asociada a un corte y empalme disfuncional del ARNt, preferentemente una hipoplasia pontocerebelar.