Uso de duplos horquillados de ARN bicatenarios en el silenciamiento genético.

Un método para la creación de un elemento vegetal que codifica los duplos ARNbcl mal emparejados que cuentan con un núcleo de más de 100 nucleótidos de longitud y un bucle que no incluye un intrón,

incluyendo el método los pasos de:

(i) amplificación de un fragmento de ADN del gen diana;

(ii) tratamiento de una fracción del fragmento de ADN del gen diana con bisulfito, causando así una mutación química arbitraria de nucleótidos de citosina a nucleótidos timina;

(iii) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud;

(iv) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud; y

(v) ligadura del fragmento tratado y del no tratado del gen diana para que el fragmento tratado y el no tratado estén en una orientación de direcciones opuestas, respectivamente.

Uso de duplos horquillados de ARN bicatenarios en el silenciamiento genético

Contexto del invento

Este invento tiene que ver con el silenciamiento genético. En particular, el invento se relaciona al uso de duplos horquillados de ARN bicatenarios en el silenciamiento genético.

Se pueden usar ARN horquillados cortos (ARNhc) expresados a partir de promotores ARN Pol II y Pol III para silenciar los genes diana. Los ARNhc se expresan en el núcleo, y al igual que los microARN (miARN) , se transportan al citoplasma, donde la maquinaria de interferencia por ARN (iARN) produce ARN interferentes pequeños (ARNip) . Normalmente, ARNhc incluyen duplos ARN bicatenarios (ARNbc) de hasta 30 pares de base (bp) o nucleótidos, lo que limita el número de ARNip funcionales que pueden generarse a partir de la horquilla precursora.

Los ARNbc horquillados largos (ARNhl) y los duplos ARNbc pueden procesarse mediante la maquinaria iARN y transformarse en ARNip funcionales. Normalmente, ARNhl y los duplos ARNbc contienen al menos tres eventos de división DICER y por ello tienen entre 60bp y 66bo, e incluso más.

Es importante tener en cuenta que ARNhl son capaces de generar diferentes ARNip, y el número de los diferentes ARNip diana generados es directamente proporcional a la longitud de los duplos ARNbc (es decir, los ARNhl) . Aparte de tener como meta una mayor secuencia genética, los múltiples ARNic tienen diferentes dianas al mismo tiempo, evitando la posible creación de variantes mutantes (es decir, para las secuencias de genes virales o cancerígenos) que pueden "salirse" de los efectos buscados por ARNip. La escapada mutacional es un fenómeno observado con frecuencia en los estudios que usan ARNhp y ARNip contra dianas virales, y no sólo se limita a la secuencia diana, sino que también se usa en secuencias flanqueantes que afectan a las estructuras secundarias ARN locales.

Sin embargo, existen dificultades a la hora de clonar hoquillas ARNbcl. Además, los duplos largos de ARNbc usados en las células mamíferas son conocidos por activar el sistema no específico de respuesta interferón en células mamíferas (p.ej.: las vías PKR y Rnase L) . Estas dificultades en la clonación y en el efecto inmuno-estimulatorio han limitado la aplicación generalizada de horquillas largas para el silenciamiento genético en las células mamíferas y en otras células. Referencia a AKASHI HIDEO ET AL: "Escape de la respuesta interferón asociada con la interferencia ARN mediante el uso de vectores que codifican horquillas largas modificadas ARN", publicado en BIOSISTEMAS

MOLECULARES, SOCIEDAD REAL DE QUÍMICA, vol.1, nº 5-6, 1 de diciembre de 2005, la cual revela una metodología diseñada para evitar la respuesta interferón durante el silenciamiento genético en mamíferos, y encuentra aplicación para ARNbc. Aunque el método revelado es efectivo, hay un problema al extender la metodología enseñada en este documento para generar ARNbcl mayores de 220bp, y es que los ARNbcl, cuando se ordenan en direcciones opuestas, tienen una tendencia a formar una estructura de ADN cruciforme. Las mayores dificultades respecto a repeticiones largas directamente invertidas se encuentran en la formación de cruces cruciformes, los cuales causan inestabilidad genética. Esto puede provocar la re-organización o a la división de los elementos de ADN ya que la maquinaria de recombinación de la célula podría reconocer a los cruces cruciformes como cruces Holliday, los cuales son substratos de recombinación homóloga.

Resumen del invento

Según una primera encarnación del invento, se ha proporcionado un método para construir un elemento vegetal mediante la codificación de un duplo ARNbcl incompatible con un tallo de más de 100 nucleótidos de longitud y un bucle que no incluye un intrón, el método incluye los siguientes pasos:

(i) amplificar un fragmento de AND del gen Diana;

(ii) tratar una fracción del fragmento de AND del gen Diana con bisulfito, causando por consiguiente una mutación

química aleatoria de nucleótidos citosina a nucleótidos timina; 55

(iii) se ejecuta una RCP en un fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud;

(iv) se ejecuta una RCP en un fragmento sin tratar para generar un fragmento sin tratar de más de 100 nucleótidos de longitud;

(v) se ligan los fragmentos tratados a los fragmentos sin tratar del gen diana para que los fragmentos tratados y sin tratar estén ordenados unos al lado de los otros, respectivamente.

Puede que exista una secuencia de intervención de codificación en bucle entre el fragmento tratado y el que está sin tratar. Esta secuencia de horquilla interventora de codificación en bucle puede incluir al menos un sitio de restricción.

El método puede incluir además el paso de clonación del elemento que codifica el duplo ARNbcl e insertarlo en el casete de expresión.

Según otra encarnación del invento, se proporciona un ADN polinucleótido construido de acuerdo al método de arriba, que comprende:

una secuencia sin modificar de un gen vegetal diana o una parte de la misma consistente en más de 100 nucleótidos de longitud; y una secuencia modificada de un gen vegetal diana o una parte de la misma consistente en más de 100 nucleótidos de longitud, en la que la secuencia modificada difiere de la secuencia sin modificar en el hecho de que los nucleótidos citosinos aleatorios en la secuencia genética diana o la parte de la misma que ha sido modificada a nucleótidos timina mediante mutación bisulfita;

en la que tanto la secuencia modificada como la no modificada se encuentran en dirección inversa a la otra secuencia; y en la que la secuencia ARN transcrita del ADN polinucleótido forma un duplo entre la secuencia modificada y la no modificada para que un duplo ARN bicatenario largo (ARNbcl) con un núcleo de más de 100 nucleótidos de longitud entre las secuencias modificadas y las no modificadas con desequilibrios de pares de base donde los nucleótidos se han modificado, pudiendo el duplo ARNbcl inhibir la expresión del gen diana.

Las modificaciones de nucleótidos son modificaciones de nucleótidos citosina a timina, y la proporción de 25 modificaciones de nucleótidos puede ser de uno cada cuatro a 10 nucleótidos.

Puede haber otra secuencia de nucleótidos entre las secuencias modificadas y las complementarias, formando dicha secuencia de nucleótidos un bucle de horquilla en la secuencia ARN entre las secuencias modificadas y las complementarias.

El gen diana puede seleccionarse a partir del grupo formado por genes metazoarios, vegetales y virales. Los genes metazoarios pueden contener genes de mamíferos, de insectos y nematodos. EN particular, el gen diana puede ser un gen BC1 o AC1 del mosaico vírico de la yuca sudafricana (SACMV) .

Cuando el gen diana es el gen SACMV BC1, la secuencia modificada puede contener la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 13, 16, 17 o 18, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma; y el fragmento complementario puede contener una secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 14, 15, 19 o 20, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma. Por ejemplo, el polinucleótido puede incluir la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21.

Cuando el gen diana es el gen SACMV AC1, la secuencia modificada puede contener la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 33, 34, 35, 38, 39 o 40, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma; y la secuencia complementaria puede contener una secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 36, 37, 41 o 42, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma. Por 45 ejemplo, el polinucleótido puede incluir la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53.

Las secuencias modificadas y complementarias pueden consistir en más de 60 nucleótidos.

Las secuencias modificadas y complementarias pueden consistir en más de 80 nucleótidos.

Las secuencias modificadas y complementarias pueden consistir en más de 100 nucleótidos.

La amplificación de cadena específica puede usarse para amplificar las secuencias modificadas y complementarias, de forma que se asegure de que la cadena correcta del gen diana se amplifica.

Aquí también se discute un ARN polinucleótido que corresponde al ADN polinucleótido descrito arriba.

Las modificaciones de nucleótidos en la secuencia modificada son modificaciones de citosina a uracilo, de forma que las discordancias de pares de base son discordancias G:U.

La secuencia modificada puede estar expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO:... [Seguir leyendo]

1. Un método para la creación de un elemento vegetal que codifica los duplos ARNbcl mal emparejados que cuentan con un núcleo de más de 100 nucleótidos de longitud y un bucle que no incluye un intrón, incluyendo el método los 5 pasos de:

(i) amplificación de un fragmento de ADN del gen diana;

(ii) tratamiento de una fracción del fragmento de ADN del gen diana con bisulfito, causando así una mutación 10 química arbitraria de nucleótidos de citosina a nucleótidos timina;

(iii) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud;

(iv) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud; y (v) ligadura del fragmento tratado y del no tratado del gen diana para que el fragmento tratado y el no tratado estén en una orientación de direcciones opuestas, respectivamente. 20

2. Un método, según la especificación 1, en el que hay una secuencia interventora de codificación en bucle entre el fragmento tratado y el no tratado, preferiblemente incluyendo al menos un lugar de restricción.

3. Un método, según las especificaciones 1 o 2, en el que se incluyen los pasos de clonación del elemento 25 codificando el duplo ARNbcl e insertándolo en un casete de expresión.

4. Un método, según las especificaciones 1 o 2, en el que la proporción de bases mal emparejadas en el fragmento tratado comparado con el fragmento no tratado es de uno cada 4 a cada 10 nucleótidos.

5. Un método de silenciar el gen diana en una planta, incluyendo el método los pasos de:

(i) construir una construcción de acuerdo al método de las especificaciones 1 a 4;

(ii) introducir un casete de expresión que incluya el elemento dentro de una planta; y 35

(iii) hacer que el casete de expresión exprese una secuencia ARN codificada por el elemento que silencia el mencionado gen diana.

6. Un polinucleótido ADN construido de acuerdo al método de cualquiera de las especificaciones 1 a 4 incluyendo: 40

(i) una secuencia no modificada de un gen vegetal Diana o de una parte del mismo consistente en más de 100 nucleótidos de longitud; y

(ii) una secuencia modificada del gen diana o de parte del mismo consistente en más de 100 nucleótidos de longitud,

donde la secuencia modificada difiere de la secuencia no modificada en el hecho de que se han modificado nucleótidos de citosina aleatorios en la secuencia de gen diana, o de parte de la misma, convirtiéndolos en nucleótidos de timina mediante la mutación del bisulfito;

donde cada una de la secuencia modificada o de la no modificada está orientación inversa respecto a la otra 50 secuencia, y donde la secuencia ARN transcrita a partir de un polinucleótido de ADN forma un duplo entre la secuencia modificada y la no modificada para que un duplo ARN bicatenario largo (ARNbcl) con un núcleo mayor de 100 nucleótidos de longitud se forme entre las secuencias modificadas y no modificadas con desajustes en los pares de 55 base donde los nucleótidos se han modificado, siendo el duplo ARNbcl capaz de inhibir la expresión del gen diana.

7. Un polinucleótido de acuerdo a la especificación 6, donde la secuencia modificada y la no modificada están orientados en direcciones opuestas, respectivamente.

8. Un polinucleótido de acuerdo a las especificaciones 6 o 7, donde la proporción de las modificaciones de nucleótidos es de uno cada cuatro a 10 nucleótidos.

9. Un polinucleótido de acuerdo a las especificaciones 6 a 8, que incluye una secuencia de nucleótidos más entre las secuencias modificadas y las no modificadas, formando la secuencia nucleótida extra una horquilla en bucle en la 65 secuencia ARN entre las secuencias modificadas y las no modificadas.

10. Un polinucleótido de acuerdo a las especificaciones 6 a 9, donde el gen diana es un gen AC1 o BC1 proveniente del virus mosaico de la yuca sudafricana (SACMV) , preferiblemente donde la secuencia modificada tenga la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 13, 16, 17 o 18 o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma, o es una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 38, 39 o 40 o una secuencia expuesta en de SEQ ID NO: 21 o de SEQ ID NO: 53.

11. Un vector de ácido nucleico que incluya un casete de expresión con polinucleótido de ADN de cualquier de las especificaciones 6 a 10.