Uso de cobre y glutamato en cultivos celulares para producción de polipéptidos.

Un procedimiento de producción de un polipéptido en un cultivo celular que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica un polipéptido de interés en un medio de cultivo celular que comprende entre 0,5 y 5 μM de cobre y entre 1,7 y 33 mM de glutamato;

mantener el cultivo en un primer intervalo de temperaturas durante un primer periodo de tiempo suficiente para permitir que las células se reproduzcan hasta una densidad celular viable en el intervalo de un 20%-80% de la máxima densidad celular viable posible si el cultivo se mantuviera en el primer intervalo de temperaturas; cambiar el cultivo a un segundo intervalo de temperaturas, en que al menos una temperatura del segundo intervalo de temperaturas es más baja que la temperatura más baja del primer intervalo de temperaturas; mantener el cultivo durante un segundo periodo de tiempo bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión del polipéptido, en el que la fracción de polipéptido mal plegado y/o agregado, con respecto al total de polipéptido producido, está disminuido en comparación con la fracción de polipéptido mal plegado y/o agregado que se observaría bajo condiciones del medio de otra manera idénticas que carezcan de cobre y glutamato;

en que el polipéptido es TNFR-Ig.

Uso de cobre y glutamato en cultivos celulares para producción de polipéptidos Referencia cruzada con Solicitudes relacionadas La presente solicitud está en tramitación junto con, comparte al menos un inventor común con, y reivindica la prioridad a, la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nº 60/892.749 presentada el 2 de marzo de 2007.

Antecedentes Las proteínas y polipéptidos han llegado a convertirse gradualmente en importantes agentes terapéuticos. En la mayoría de los casos, estas proteínas y polipéptidos se producen en cultivos celulares, a partir de células que se han modificado y/o seleccionado para producir niveles inusualmente altos de la proteína o polipéptido particular de interés. El control y optimización de las condiciones del cultivo celular son importantes para el éxito de la producción comercial de proteínas y polipéptidos.

Muchas proteínas y polipéptidos producidas en cultivos celulares se fabrican en un proceso discontinuo o semicontinuo, en el que las células se cultivan durante un periodo de tiempo, y luego se termina el cultivo y se aíslan la proteína o polipéptido producidos. De manera alternativa, las proteínas o polipéptidos se pueden producir en un proceso de cultivo celular de perfusión en el que el cultivo no se termina y se añaden nuevos nutrientes y otros componentes periódica o continuamente al cultivo, y durante el cual la proteína o polipéptido que se expresa se recolecta periódica o continuamente. La cantidad final y la calidad de la proteína o polipéptido producidos pueden afectarse drásticamente por las condiciones del cultivo celular. Por ejemplo, los procesos tradicionales discontinuos o semicontinuos a menudo dan como resultado proteínas o polipéptidos que están mal plegados y/o están en forma de agregados. El aumento de los niveles de proteínas o polipéptidos mal plegados y/o agregados tiende a producir rendimientos totales más bajos o proteínas o polipéptidos plegados correctamente y/o no agregados. Además, los procesos tradicionales discontinuos o semicontinuos a menudo dan como resultado proteínas o polipéptidos con patrones de glucosilación menos extensos o indeseables por otra razón.

Un sistema de producción de proteínas o polipéptidos que se plieguen correctamente, se agreguen menos fácilmente o tengan un patrón de glucosilación más deseable podría dar como resultado un agente terapéutico proteico o polipeptídico con mayor potencia y menos efectos secundarios. Por lo tanto, existe una necesidad de sistemas y composiciones mejoradas que den como resultado una producción de una proteína o polipéptido que se pliegue correctamente, se agregue menos y/o tenga un patrón de glucosilación más deseable. Existe una necesidad particular de desarrollo de sistemas mejorados para producir proteínas o polipéptidos en un cultivo celular que se cultiven en medios definidos. Los documentos US6048728, WO2006108455, US6162643, US6103529 y US4767704 se refieren al procedimiento de cultivo celular.

Sumario La presente invención proporciona sistemas mejorados para la producción a gran escala de proteínas y/o polipéptidos en cultivos celulares. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un sistema para producir una proteína o polipéptido en un medio de cultivo celular que comprende cobre. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un sistema para producir una proteína o polipéptido en un medio de cultivo celular que comprende glutamato. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un sistema de producción de una proteína o polipéptido en un medio de cultivo celular que comprende tanto cobre como glutamato. En ciertas realizaciones, los medios de cultivo celular de la presente invención se utilizan para cultivar células de mamífero que expresan la proteína o polipéptido de interés.

En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos de cultivo a gran escala (por ejemplo, 500 l o más) que utilizan un medio que contiene cobre y/o glutamato. En ciertas realizaciones, los procedimientos de cultivo como se enseña en la presente divulgación incluyen uno o más cambios de temperatura durante el curso del cultivo celular. De acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención, el uso de tales procedimientos da como resultado niveles mayores de proteínas o polipéptidos plegados correctamente que los que se observarían en un polipéptido que se cultive en un medio por otra parte idéntico bajo condiciones de cultivo por otra parte idénticas. Además, de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención, el uso de tales procedimientos da como resultado la producción de un polipéptido con un patrón más extenso o por otra parte más deseable que el que se observaría en un polipéptido que se cultive en un medio por otra parte idéntico bajo condiciones de cultivo por otra parte idénticas. En ciertas realizaciones, el uso de tales procedimientos da como resultado la producción de un polipéptido con un aumento de la sialilación total que la que se observaría en un polipéptido que se cultive en un medio por otra parte idéntico bajo condiciones de cultivo por otra parte idénticas.

Un experto en la técnica comprenderá que las formulaciones de los medios de la presente divulgación engloban medios tanto definidos como complejos. En ciertas realizaciones, el medio de cultivo es un medio definido en que la composición del medio se conoce y se controla.

En algunas realizaciones, las células se cultivan bajo una o más de las condiciones que se describen en las Solicitudes de Patentes de Estados Unidos Nos de serie 11/213.308, 11/213.317 y 11/213.633, cada una de las cuales se presentó el 25 de agosto de 2005. En algunas realizaciones, las células se cultivan bajo una o más de las condiciones descritas en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nº de serie 60/830.658, presentada el 13 de julio de 2006. En algunas realizaciones, las células se cultivan bajo una o más de las condiciones descritas en en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nº de serie 60/856.615, presentada el 3 de noviembre de 2006.

Los cultivos celulares de la presente invención se pueden suplementar opcionalmente con nutrientes y/u otros componentes del medio que incluyen por ejemplo hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio, y/o fosfato) , tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, elementos traza (compuestos inorgánicos presentes habitualmente a concentraciones finales muy bajas) , aminoácidos, lípidos, y/o glucosa u otras fuentes de energía. En ciertas realizaciones, puede ser beneficioso suplementar los medios con uno o más inductores químicos tales como hexametileno-bis (acetamida) (“HMBA”) y butirato sódico (“NaB”) . Estos suplementos opcionales se pueden añadir al principio del cultivo o se pueden añadir en un punto más tarde con el fin de rellenar los nutrientes gastados o por otra razón. En ciertas realizaciones, es deseable seleccionar la composición inicial del medio para minimizar la suplementación de acuerdo con la presente invención.

En ciertas realizaciones, el tiempo total que se deja transcurrir un cultivo celular determinado está aumentado significativamente más allá de los tiempos de cultivo tradicionales, aumentando de esta manera el rendimiento y la calidad de cualquier polipéptido que se produzca en el cultivo celular y proporcionando una mayor flexibilidad al facultativo para determinar el tiempo apropiado u óptimo en el que las células cultivadas expresan un polipéptido de interés.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra la densidad celular integrada viable (IVCD) de los cultivos celulares cultivados bajo las condiciones experimentales descritas en la Tabla 3.

La Figura 2 muestra la productividad específica acumulativa (Qp) de los cultivos celulares cultivados bajo las condiciones experimentales descritas en la Tabla 3.

La Figura 3 muestra los niveles de glutamato de los cultivos celulares cultivados bajo las condiciones experimentales descritas en la Tabla 3.

La Figura 4 muestra los niveles de lactato de los cultivos celulares cultivados bajo las condiciones experimentales descritas en la Tabla 3.

La Figura 5 muestra el nivel relativo del Día 10 de la TNFR-Ig mal plegada y/o agregada que se produce y el título a Día 10 de los cultivos celulares cultivados bajo las condiciones experimentales descritas en la Tabla 3.

La Figura 6 muestra la densidad celular integrada viable (IVCD) de los cultivos celulares cultivados bajo las condiciones experimentales descritas en la Tabla 4.

La Figura 7 muestra la productividad específica... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de un polipéptido en un cultivo celular que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica un polipéptido de interés en un medio de cultivo celular que comprende entre 0, 5 y 5 μM de cobre y entre 1, 7 y 33 mM de glutamato; mantener el cultivo en un primer intervalo de temperaturas durante un primer periodo de tiempo suficiente para permitir que las células se reproduzcan hasta una densidad celular viable en el intervalo de u.

20. 80% de la máxima densidad celular viable posible si el cultivo se mantuviera en el primer intervalo de temperaturas; cambiar el cultivo a un segundo intervalo de temperaturas, en que al menos una temperatura del segundo intervalo de temperaturas es más baja que la temperatura más baja del primer intervalo de temperaturas; mantener el cultivo durante un segundo periodo de tiempo bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión del polipéptido, en el que la fracción de polipéptido mal plegado y/o agregado, con respecto al total de polipéptido producido, está disminuido en comparación con la fracción de polipéptido mal plegado y/o agregado que se observaría bajo condiciones del medio de otra manera idénticas que carezcan de cobre y glutamato;

en que el polipéptido es TNFR-Ig.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer intervalo de temperaturas comprende un intervalo de temperaturas que es de 30 a 42 grados Celsius.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el segundo intervalo de temperaturas comprende un intervalo de temperaturas que es de 25 a 41 grados Celsius.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que incluye una segunda etapa de cambio posterior a dicha primera etapa de cambio que comprende el cambio de dicho cultivo a una tercera temperatura o tercer intervalo de temperaturas, en el que al menos una temperatura del tercer intervalo de temperaturas es más baja que la temperatura más baja del segundo intervalo de temperaturas.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el tercer intervalo de temperaturas comprende un intervalo de temperaturas que es 25 a 40 grados Celsius.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración inicial de glutamina del medio de cultivo celular es menor o igual a 4 mM.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cultivo celular es suplementado además con 2 gramos por litro de glucosa.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cultivo celular es suplementado además con componentes suplementarios.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los componentes suplementarios son proporcionados en un medio de alimentación.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que los componentes suplementarios son proporcionados en múltiples intervalos.

11. El procedimiento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo celular es definido.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el medio de cultivo celular definido no contiene suero ni hidrolizados añadidos.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el medio de cultivo celular definido está libre de proteínas.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo celular comprende entre 0, 7 y 1, 5 μM de cobre.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el medio de cultivo celular comprende 1 μM de cobre.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo celular comprende entre 3 y 7 mM de glutamato.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el medio de cultivo celular comprende 5 mM de glutamato.

18. Un procedimiento de producción de un polipéptido en un cultivo celular que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica un polipéptido de interés en un medio de cultivo

celular que comprende entre 0, 5 y 5 μM de cobre y entre 1, 7 y 33 mM de glutamato; mantener el cultivo en un primer intervalo de temperaturas durante un primer periodo de tiempo suficiente para permitir que las células se reproduzcan hasta una densidad celular viable en un intervalo de.

20. 80% de la máxima densidad celular viable posible si el cultivo se mantuviera en el primer intervalo de temperaturas;

cambiar el cultivo a un segundo intervalo de temperaturas, en el que al menos una temperatura del segundo intervalo de temperaturas es más baja que la temperatura más baja del primer intervalo de temperaturas; mantener el cultivo durante un segundo periodo de tiempo bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión del polipéptido, en el que el patrón de glucosilación del polipéptido expresado está aumentado con respecto al patrón de glucosilación que se observaría bajo condiciones del medio de otra manera idénticas que carezca de cobre y glutamato;

en que el polipéptido es TNFR-Ig.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el aumento del patrón de glucosilación del polipéptido expresado comprende un aumento de la sialilación total.

20. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el medio de cultivo celular es definido.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el medio de cultivo celular definido no contiene suero ni hidrolizados añadidos.

22. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el medio de cultivo celular definido está libre de proteínas.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18-22, en el que el medio de cultivo celular comprende entre 0, 7 y 1, 5 μM de cobre.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el medio de cultivo celular comprende 1 μM de cobre.

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18-22, en el que el medio de cultivo celular comprende entre 3 y 7 mM de glutamato.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que el medio de cultivo celular comprende 5 mM de glutamato.

27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que el polipéptido es TNFR-Fc.

28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-27, el que la etapa de cultivo comprende el cultivo de células de mamífero en un cultivo discontinuo.

29. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-28, en el que el polipéptido o proteína están aislados y/o purificados.