Un gen que codifica un homólogo de glicoproteína P humana multifármaco-resistente en el cromosoma 7p15-21 y usos del mismo.

Un método de enriquecimiento de células madre a partir de una mezcla celular,

que comprende

poner en contacto una mezcla celular con un anticuerpo monoclonal específico que reacciona específicamente con una glicoproteína P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, NO:6, NO:7 y NO:8 y aislar células madre unidas al anticuerpo a partir de la mezcla celular,

donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.

Un gen que codifica un homólogo de glicoproteína P humana multifármaco-resistente en el cromosoma 7p15-21 y usos del mismo.

Campo de la Invención La invención se refiere a secuencias genéticas que codifican proteínas que exhiben rasgos estructurales y 5 funcionales característicos de los miembros de la familia de la glicoproteína P asociados con la multifármaco-resistencia del cáncer, funciones reguladoras inmunológicas, y funciones singulares en células madre pluripotentes humanas y otras células tisulares progenitoras. La invención abarca proteínas sustancialmente puras, tratamientos terapéuticos y usos diagnósticos relacionados con estas proteínas.

Antecedentes de la Invención 10

La glicoproteína P, una bomba de eflujo de fármacos dependiente de adenosina-trifosfato (ATP) , está sobreexpresada en células tumorales multifármaco-resistentes (MDR) . La misma reduce la concentración intracelular de xenobióticos citotóxicos, reduciendo con ello la eficacia de muchos regímenes quimioterapéuticos del cáncer. La glicoproteína P pertenece a la superfamilia de transportadores activos ABC (casete de fijación de ATP) , y está codificada por una familia de multigenes en los eucariotas superiores. Los miembros de la familia de 15 glicoproteínas P de mamíferos pueden dividirse en tres clases. Las glicoproteínas P de clase I y clase II confieren multifármaco-resistencia, mientras que las proteínas de clase III no lo hacen.

En los humanos, la glicoproteína P está codificada por dos genes enlazados ("MDR1" y "MDR3") en el cromosoma 7q21.1. MDR3 funciona como una translocasa lipídica y las mutaciones en este gen están asociadas con colestasis intrahepática familiar. MDR1 confiere resistencia a fármacos en las células de ciertos cánceres. Además de estar 20 sobreexpresada en las células del cáncer, la glicoproteína P MDR1 se expresa ampliamente en los tejidos humanos normales, predominantemente secretorios y absorbentes, donde la misma funciona en diversos procesos fisiológicos que incluyen diferenciación celular, proliferación celular y supervivencia celular. En estos tipos de células normales, la glicoproteína P funciona en la liberación o captura transmembranal o de xenobióticos y ciertos fármacos terapéuticos, pequeñas moléculas peptídicas, ciertos compuestos esteroidales, y fosfolípidos. 25

La glicoproteína P es expresada también por poblaciones de células linfoides de la médula ósea humana y la sangre periférica. Específicamente, se ha demostrado que la glicoproteína P se expresa en la membrana de células madre pluripotentes, monocitos, células dendríticas, linfocitos T CD4+ y CD8+, células agresoras naturales, y linfocitos B. En las células inmunológicas, la glicoproteína P funciona en el transporte de citoquinas y otras moléculas pequeñas, que son críticas para que se produzcan las respuestas inmunológicas fisiológicas. El bloqueo 30 específico de la glicoproteína P puede suprimir la respuesta inmunológica a aloantígenos y antígenos nominales. Sin embargo, existe cierto grado de redundancia para la función de la glicoproteína P en estos tipos de células, que apunta a la existencia de moléculas afines adicionales no identificadas hasta ahora.

Las células madre pluripotentes y otras células progenitoras tisulares poseen también una actividad singular semejante a la glicoproteína P, caracterizada por acumulación intracelular reducida de colorantes fluorescentes, que 35 permite el aislamiento específico de estos tipos de células para usos terapéuticos. No obstante, se cree que esta función no está mediada por la glicoproteína P MDR1, sino más bien por un miembro de la familia de glicoproteínas P afín, no identificado todavía.

A pesar del papel irrefutable de la glicoproteína P MDR1 en la multifármaco-resistencia del cáncer, los intentos de mejorar la quimioterapia por inhibición de esta proteína han alcanzado sólo un éxito limitado. Así, puede inferirse 40 que existen proteínas homólogas que, como MDR1, son capaces de hacer las células resistentes a los agentes terapéuticos. Adicionalmente, puede inferirse que las proteínas MDR1 homólogas cumplen funciones semejantes a la glicoproteína P en los tejidos humanos fisiológicos, en particular en células del sistema inmunitario, células madre pluripotentes y células progenitoras tisulares, donde existe cualquier redundancia para la función de la glicoproteína P MDR1, o donde se sabe que la glicoproteína P MDR1 no promueve la actividad observada asociada a la 45 glicoproteína P.

Sumario de la Invención La invención está dirigida a un nuevo miembro de la familia de genes de glicoproteínas P humanas localizado en el cromosoma 7p15-2, que codifican proteínas que confieren el fenotipo multifármaco-resistente a las células tumorales y/o atienden a funciones fisiológicas críticas en los tejidos humanos normales. 50

Un examen de la estructura del nuevo gen indica que el mismo codifica dos mitades homólogas semiautónomas, cada una de ellas con sus propios dominios transmembranales y de fijación de ATP. Por remodelación alternativa y expresión diferencial de genes y/o modificaciones posteriores a la transcripción y posteriores a la traducción, el nuevo gen de glicoproteína P puede codificar varias glicoproteínas P distintas:

La proteína de SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-659) está codificada por 14 exones (SEQ ID NO: 9) del DNA 55 genómico humano del clon AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 5 dominios transmembranales y un dominio de fijación de ATP.

La proteína de SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 1-812) está codificada por 19 exones (SEQ ID NO: 10) del DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 (AC002486 es el clon secuenciado a la izquierda del clon AC005060) en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 5 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado en el lado N-terminal del dominio transmembranal #1, y el segundo en el lado C-terminal del dominio transmembranal #5 de la proteína, en el lado opuesto de la membrana 5 plasmática. La proteína de SEQ ID NO: 2 puede expresarse también como resultado de la trans-remodelación del mRNA (SEQ ID NO: 9) que codifica la proteína de SEQ ID NO: 1 y el mRNA (SEQ ID NO: 11) que codifica la proteína de SEQ ID NO: 3 descrita más adelante. Adicionalmente, la proteína de SEQ ID NO: 2 puede expresarse como resultado del procesamiento posterior a la traducción de las proteínas de SEQ ID NO: 1 y NO: 3.

La proteína de SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 1-131) está codificada por 6 exones (SEQ ID NO: 11) del DNA 10 genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por un solo dominio de fijación de ATP, careciendo de dominios transmembranales.

La proteína de SEQ ID NO: 4 (aminoácidos 1-1058) está codificada por 20 exones (SEQ ID NO: 12) del DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 8 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado entre los 15 dominios transmembranales #3 y #4, y el segundo en el lado C-terminal de los dominios transmembranales #8, en el lado opuesto de la membrana plasmática.

La proteína de SEQ ID NO: 5 (aminoácidos 1-1222) está codificada por 23 exones (SEQ ID NO: 13) de DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 12 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado entre los 20 dominios transmembranales #7 y #8, y el segundo en el lado C-terminal del dominio transmembranal #12, en el lado opuesto de la membrana plasmática.

La proteína de SEQ ID NO: 6 (aminoácidos 1-1195) está codificada por 24 exones (SEQ ID NO: 14) de DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 11 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado entre los 25 dominios transmembranales #6 y #7, y el segundo en el lado C-terminal del dominio transmembranal #11, en el lado opuesto de la membrana plasmática.

La proteína de SEQ ID NO: 7 (aminoácidos 1-541) está codificada por 10 exones (SEQ ID NO: 15) de DNA genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 7 dominios transmembranales y un solo dominio de fijación de ATP, en el lado C-terminal del dominio transmembranal #7. 30

La proteína de SEQ ID NO: 8 (aminoácidos 1-514) está codificada por 11 exones (SEQ ID NO: 16) de DNA genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida... [Seguir leyendo]

1. Un método de enriquecimiento de células madre a partir de una mezcla celular, que comprende poner en contacto una mezcla celular con un anticuerpo monoclonal específico que reacciona específicamente con una glicoproteína P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, NO:6, NO:7 y NO:8 y aislar células madre unidas al anticuerpo a partir de la mezcla 5 celular, donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.

2. Un método para obtener células madre positivas para la glicoproteína P 7p que comprende:

aislar las células positivas para la glicoproteína P 7p a partir de una muestra de células madre, donde las células positivas para la glicoproteína P 7p se aíslan utilizando un anticuerpo monoclonal específico contra la glicoproteína 10 P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, NO:6, NO:7 y NO:8, y donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.

3. El método de la reivindicación 2, donde las células positivas para glicoproteína P 7p se aíslan utilizando un anticuerpo inmovilizado contra la glicoproteína P 7p. 15

4. El método de la reivindicación 3, donde el anticuerpo está inmovilizado en microesferas.

5. El método de la reivindicación 2, donde las células con glicoproteína P 7p se aíslan utilizando un análisis FACS.

6. Un método de caracterización de una célula madre, que comprende poner en contacto una célula madre con un anticuerpo monoclonal específico dirigido contra una glicoproteína P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, 20 NO:6, NO:7 y NO:8 para determinar si la célula madre es positiva para la glicoproteína P 7p, donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.