Transferencia de exosomas de ácidos nucleicos a células.

Un método para la producción de exosomas in vitro que contienen un constructo de un ácido nucleico seleccionado,

que comprende:

a) el aislamiento de los exosomas que tienen un tamaño en el intervalo de entre 30 y 100 nm, a partir de células que crecen in vitro o a partir de células que han sido obtenidas a partir de un ser humano o de un animal; y

b) la introducción del constructo de un ácido nucleico seleccionado directamente en los exosomas aislados.

Transferencia de exosomas de ácidos nucleicos a células Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se basa en el inesperado hallazgo de que los exosomas liberados en el medio extracelular pueden portar un ARN selectivo de las células parentales. La invención se refiere a un método de producción de los exosomas que contienen un constructo de un ácido nucleico seleccionado. Esto puede usarse, de acuerdo con esta invención, para transferir material genético a células receptoras mediante exosomas. Mediante la transferencia de ácidos nucleicos a células receptoras, los exosomas afectan a la maquinaria proteica de otras células (las células receptoras) y por lo tanto al contenido en proteínas, y la invención demuestra por primera vez que los ácidos nucleicos, por ejemplo, ARN y ADN, pueden ser transferidos deliberadamente entre células u órganos mediante el uso de exosomas, y pueden utilizarse por tanto para la modulación y la terapia génica en células de mamífero.

Descripción de la técnica relacionada Los exosomas son pequeñas vesículas membranales de origen endocítico que son liberadas en el entorno extracelular después de la fusión de los cuerpos multivesiculares con la membrana plasmática. El tamaño de los exosomas varía entre 30 y 100 nm de diámetro. Su superficie consiste en una bicapa lipídica de la membrana celular de la célula donante, y contienen el citosol de la célula que produjo el exosoma, y muestra las proteínas de membrana de la célula parental en la superficie.

Los exosomas muestran una composición y una función diferentes dependiendo del tipo celular del que deriven. No hay proteínas "específicas de exosomas"; sin embargo, varias de las proteínas identificadas en estas vesículas están asociadas a endosomas y a lisosomas, lo que es un reflejo de su origen. La mayoría de los exosomas son ricos en MHC I y II (complejo mayor de histocompatibilidad I y II; importantes para la presentación del antígeno a las células inmunocompetentes tales como los linfocitos T) , tetraespaninas, diversas proteínas de choque térmico, componentes del citoesqueleto tales como actinas y tubulinas, proteínas implicadas en la fusión de la membrana intracelular, proteínas de traducción de señales y enzimas citosólicas.

Los exosomas son producidos por muchas células, incluyendo las células epiteliales y los linfocitos B y T, los mastocitos (MC) así como las células dendríticas (DC) . En los seres humanos, se han encontrado exosomas en sangre, en orina, en el líquido de lavado broncoalveolar, en las células epiteliales intestinales y en los tejidos tumorales.

No se han determinado todas las funciones de los exosomas, pero los datos indican fuertemente que median en la comunicación entre las células. Esta comunicación podría tener lugar de diferentes formas. En primer lugar, podrían unirse los exosomas a un receptor de la superficie celular de una forma similar a la interacción entre células. En segundo lugar, los exosomas podrían adherirse a la membrana celular y proporcionar a las células nuevos receptores y propiedades. Por lo tanto, los exosomas también pueden fusionarse con células objetivo e intercambiar proteínas de membrana y citosol entre dos tipos celulares. El documento WO 2005/121369 describe el uso de diversas microvesículas como agentes terapéuticos, en los que, por ejemplo, el ARN o las proteínas encapsuladas o acopladas a las microvesículas, proporcionan un efecto terapéutico.

J. Ratajczak et al., Leukemia (2006) 20, 847 -856 notifican que las vesículas derivadas de membrana de células madre embrionarias murinas mejoraban la supervivencia de las HPC murinas. Se averiguó que las vesículas estaban enriquecidas en la proteína Wnt-3 y en el ARNm del factor de transcripción. Sin embargo, estas microvesículas son relativamente grandes (100 nm -1 µm) y por lo tanto son distintas de los exosomas tanto en tamaño como en origen.

El documento US 2004/0028692 describe un proceso para la sensibilización de las células presentadoras del antígeno usado en inmunoterapia. El proceso utiliza los exosomas derivados de células tumorales o de células dendríticas, respectivamente, que portan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de la clase I y/o de la clase II en su superficie. Los exosomas pueden usarse como vectores para la presentación del antígeno a las células.

El documento WO 01/36601 se refiere a un método para el aislamiento del virus de la hepatitis C (HCV) . Los inventores del documento WO 01/36601 descubrieron que en los individuos infectados por el HCV, el virus se une a las partículas de exosomas del plasma sanguíneo y se concentra en las partículas de exosomas. El método propuesto comprende la separación de los exosomas del plasma sanguíneo de un individuo infectado por el HCV, y la extracción del ARN del virus a partir de las partículas de exosomas. El método puede usarse en un método de diagnóstico de la infección de un paciente por el HCV.

El documento WO 03/016522 desvela métodos para la producción de exosomas recombinantes, expresando selectivamente un polipéptido, en particular lactadherina, en los exosomas, mediante la modificación genética de las células productoras de los exosomas, de forma que el exosoma obtenido porte el polipéptido recombinante.

Una revisión de la investigación sobre exosomas publicada hasta 2005 puede encontrarse en J. Couzin, "The Ins and Outs of Exosomes", Science (2005) , 308, Nº 5730, páginas 1862 -1863. Notablemente, este artículo de revisión no habla de los exosomas como vectores para ADN o ARN no autólogos.

Hemos realizado un gran esfuerzo en la comprensión del contenido y de la función biológica de los exosomas liberados específicamente por los mastocitos. En ensayos proteinómicos hemos averiguado que estos exosomas contienen un mayor número de proteínas de lo que se creía previamente. Sin embargo, el hallazgo único de nuestra investigación es que hemos descubierto una cantidad sustancial de ARN selectivo en los exosomas de los mastocitos. Además, el uso de diferentes células receptoras muestra una captación del ARN exosómico, lo que indica una transferencia de material genético desde los exosomas a las células receptoras, que a su vez dará lugar a la traducción de la proteína específica en las células objetivo.

Considerando el contenido en proteínas del exosoma y su capacidad para comunicarse con diferentes células receptoras, es particularmente útil ser capaces de modificar el contenido genético de los exosomas con objeto de añadir o regular un gen en las células receptoras. En esta solicitud se describe el método que usa la capacidad de los exosomas de portar un material genético específico y transferirlo a células receptoras. En este método, el receptor se ve afectado en su función, así como en su capacidad para permanecer vivo, desarrollarse adicionalmente, proliferar o madurar.

El método es único y diferente de cualquier método descrito previamente. Varias patentes y solicitudes de patente usan exosomas para influir en el sistema inmunitario a través de una función estimuladora o inhibidora mediante la interacción de las proteínas exosómicas con las células inmunitarias, y para el tratamiento de una enfermedad vírica mediante una influencia en el sistema inmunitario. Se ha sugerido que las proteínas exosómicas pueden ser modificadas mediante una mutación que afecte al sistema inmunitario. Sin embargo, ninguna patente ni solicitud de patente, ni ninguna información disponible públicamente que hayamos encontrado, describe o sugiere el uso de exosomas para la transferencia de material genético o de ácidos nucleicos a células.

Resumen de la invención La presente invención desvela nuevos métodos para el suministro de constructos de ácidos nucleicos mediante exosomas a células receptoras. El método de la invención incluye constructos de ARN y de ADN que son transferidos a los exosomas de acuerdo con la reivindicación 1, mediante el uso de métodos convencionales, por ejemplo, una transformación y una transfección, para la introducción de los ácidos nucleicos directamente en los exosomas. El método de la invención es una herramienta excelente para introducir mediante terapia génica material genético en células receptoras, para compensar genes anormales o para introducir ARN o ADN que produzcan proteínas que afecten a la función de las células receptoras o a su capacidad para permanecer vivas o desarrollarse o madurar. Para la terapia génica habitualmente se usan virus o liposomas como vectores para la transferencia del material genético, debido a que pueden administrar el nuevo gen mediante la infección de una célula. El uso de exosomas... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de exosomas in vitro que contienen un constructo de un ácido nucleico seleccionado, que comprende:

a) el aislamiento de los exosomas que tienen un tamaño en el intervalo de entre 30 y 100 nm, a partir de células que crecen in vitro o a partir de células que han sido obtenidas a partir de un ser humano o de un animal; y b) la introducción del constructo de un ácido nucleico seleccionado directamente en los exosomas aislados.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el constructo de un ácido nucleico seleccionado se elige de entre el grupo que consiste en ARNm, ARNt, ARNr, ARNip, ARN regulador, ARN no codificante, ARN codificante, fragmentos de ADN y plásmidos de ADN.

3. Un método de la reivindicación 1, en el que el constructo de un ácido nucleico seleccionado es ARN. 15

4. Un método de la reivindicación 1, en el que el constructo de un ácido nucleico seleccionado es ARNip.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la introducción del constructo de un ácido nucleico seleccionado directamente en los exosomas se consigue mediante el uso de un método seleccionado de entre el grupo que

consiste en la transformación de los exosomas, la transfección de los exosomas y la microinyección del material genético seleccionado en los exosomas.

6. El método de la reivindicación 1, que además comprende la etapa de c) la transferencia del constructo de un ácido nucleico seleccionado desde los exosomas a las células receptoras in vitro. 25

7. El método de la reivindicación 6, en el que el constructo de un ácido nucleico seleccionado es transferido a las células receptoras mediante la adición de los exosomas a un cultivo celular in vitro.

8. El método de la reivindicación 6, en el que la célula receptora es una célula madre previamente adquirida a partir 30 de un donante.

9. El método de la reivindicación 6, en el que dichas células receptoras comprenden linfocitos T CD4 que pueden usarse en un método para el tratamiento de los linfocitos T infectados por el VIH, así como de neoplasias de los linfocitos T.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el constructo de un ácido nucleico seleccionado introducido en los exosomas comprende un constructo de ARN o de ADN que está diseñado específicamente para silenciar la traducción del ARN del VIH.

11. El método de la reivindicación 1, en el que los exosomas son aislados a partir de células malignas.

12. El método de la reivindicación 1, que además comprende la etapa del uso de los exosomas en la preparación de un producto farmacéutico.