Terapia de combinación para tratar trastornos de deficiencia de proteínas.

Un método para aumentar la vida útil in vitro de una β-glucocerebrosidasa de tipo salvaje humana recombinante purificada en una formulación para la administración parenteral a un ser humano,

poniendo en contacto la β- glucocerebrosidasa en un soporte farmacéuticamente aceptable con isofagomina en una cantidad eficaz para aumentar la vida útil de la β-glucocerebrosidasa.

Terapia de combinación para tratar trastornos de deficiencia de proteínas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta solicitud proporciona métodos para aumentar la vida útil in vitro de una proteína recombinante purificada, al combinar la proteína con chaperonas específicas para el sitio activo (ASSC - siglas en inglés) . La solicitud proporciona, además, composiciones que comprenden la proteína purificada y una ASSC.

ANTECEDENTES

Deficiencia de proteínas Las proteínas se sintetizan intracelularmente de acuerdo con la secuencia de nucleótidos genómica de un gen particular a través de la transcripción, traducción, y otros procesos. La deficiencia de proteínas puede ser provocada por una mutación en el gen codificante, lo que resulta en (i) la no síntesis de la proteína; (ii) la síntesis de la proteína que carece de actividad biológica; o (iii) la síntesis de la proteína que contiene la actividad biológica normal o parcial, pero que no puede ser procesada apropiadamente para alcanzar el compartimiento nativo de la proteína. A los trastornos por deficiencia de proteínas que resultan de mutaciones genéticas también se les alude como trastornos genéticos.

Además de deficiencias de proteínas que resultan de mutaciones genéticas, algunas deficiencias de proteínas surgen debido a una enfermedad, o como un efecto secundario de un tratamiento de una enfermedad (p. ej., quimioterapia) o como resultado de una insuficiencia nutricional.

Terapias actuales. Hay numerosos trastornos que resultan de deficiencias de proteínas, algunos de las cuales surgen de proteínas mutadas y mal plegadas (trastornos conformacionales - véase ínfra) . Una terapia actual para el tratamiento de deficiencias de proteínas es la terapia de reemplazo de proteínas, que implica típicamente la infusión intravenosa, subcutánea o intramuscular de una forma purificada de la correspondiente proteína de tipo salvaje, o la implantación de la proteína en una forma sólida bio-erosionable para la liberación prolongada. Una de las principales complicaciones con la terapia de reemplazo de proteínas es el logro y el mantenimiento de cantidades terapéuticamente eficaces de la proteína debido a la rápida degradación de la proteína infundida. El enfoque actual para superar este problema es llevar a cabo numerosas costosas infusiones de dosis alta.

La terapia de reemplazo de proteínas tiene varias advertencias adicionales tales como dificultades con la generación a gran escala, la purificación y el almacenamiento de proteínas adecuadamente plegadas, la obtención de proteína glicosilada nativa, la generación de una respuesta inmune anti-proteína y la incapacidad de la proteína de atravesar la barrera sangre-cerebro en enfermedades en las que esté significativamente implicado el sistema nervioso central.

La terapia génica utilizando vectores recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína funcional, o células humanas genéticamente modificadas que expresan una proteína funcional, también se está utilizando para tratar deficiencias de proteínas y otros trastornos que se benefician de la sustitución de proteínas. Aunque prometedora, este enfoque también está limitado por dificultades técnicas tales como la incapacidad de los vectores de infectar o transducir células en división, una baja expresión del gen diana y la regulación de la expresión una vez que se suministra el gen.

Un tercer enfoque, relativamente reciente, para el tratamiento de deficiencias de proteínas implica el uso de inhibidores de moléculas pequeñas para reducir el sustrato natural de las proteínas de enzima deficiente, mejorando de este modo la patología. Este enfoque de "privación de sustrato" ha sido descrito específicamente para una clase de aproximadamente 40 trastornos enzimáticos relacionados denominados trastornos de almacenamiento lisosomal o trastornos de almacenamiento glicoesfingolípido. Estos trastornos hereditarios se caracterizan por deficiencias en enzimas lisosomales que catalizan la descomposición de glicolípidos en las células, lo que resulta en una acumulación anormal de lípidos que interrumpe la función celular. Los inhibidores de moléculas pequeñas propuestos para su uso como terapia son específicos para la inhibición de las enzimas implicadas en la síntesis de glicolípidos, reduciendo la cantidad de glicolípido celular que necesita ser roto por la enzima deficiente. Este enfoque también está limitado, debido a que los glicolípidos son necesarios para la función biológica, y una privación en exceso puede provocar efectos adversos. Específicamente, los glicolípidos son utilizados por el cerebro para enviar señales de los gangliósidos de neuronas a otro. Si hay demasiados pocos o demasiados glicolípidos, se ve impedida la capacidad de la neurona para enviar señales.

Un cuarto enfoque, comentado más adelante, como estrategia específica de chaperonas, rescata proteínas mutantes de la degradación en el retículo endoplasmático.

Procesamiento de Proteínas en el Retículo Endoplasmático Las proteínas se sintetizan en el citoplasma, y las proteínas recién sintetizadas se secretan en el lumen del retículo endoplasmático (ER -siglas en inglés) en un estado ampliamente sin plegar. En general, el plegamiento de

proteínas se rige por el principio del auto-ensamblaje. Polipéptidos recién sintetizados se pliegan en su conformación nativa en base a sus secuencias de aminoácidos (Anfinsen et al., Adv. Protein Chem.1975; 29: 205-300) . In vivo, el plegamiento de proteínas es complicado, porque la combinación de temperatura ambiente y alta concentración de proteínas estimula el proceso de agregación en el que los aminoácidos normalmente enterrados en el núcleo hidrofóbico interactúan con sus vecinos de forma no específica. Para evitar este problema, el plegamiento de proteínas es generalmente facilitado por un grupo especial de proteínas llamadas chaperonas moleculares que impiden la agregación de las cadenas de polipéptido naciente, y se unen a la proteína desplegada de manera que las repliega en la conformación nativa (Hartl, Nature 1996; 381:571-580) .

Las chaperonas moleculares están presentes en prácticamente todos los tipos de células y en la mayoría de los compartimientos celulares. Algunas están involucradas en el transporte de proteínas y permiten que las células sobrevivan en circunstancias de tensión tal como un choque térmico y la inanición de glucosa (Gething et al., Nature 1992; 355:33-45; Caplan, Trends Cell Biol. 1999; 9: 262-268; Lin et al., Mol. Biol. Cell. 1993; 4:109-1119; Bergeron et al., Trends Biochem. Sci. 1994; 19:124-128) . Entre las chaperonas moleculares, Bip (proteína de unión a inmunoglobulina de cadena pesada, Grp78) es la chaperona mejor caracterizada del ER (Haas, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1991; 167:71-82) . Al igual que otras chaperonas moleculares, Bip interactúa con muchas proteínas secretoras y de la membrana dentro del ER durante su maduración, aunque la interacción es normalmente débil y de corta duración cuando el plegado discurre con fluidez. Una vez que se logra la conformación de la proteína nativa, la chaperona molecular ya no interactúa con la proteína. La unión de Bip a una proteína que fracasa en el plegamiento, ensamblaje o en la glicosilación adecuada, se vuelve estable, y conduce a la degradación de la proteína a través de la vía de degradación asociada a ER. Este proceso sirve como un sistema de "control de calidad" en el ER, lo que garantiza que sólo las proteínas correctamente plegadas y ensambladas sean transportadas fuera del ER para su posterior maduración, y las proteínas plegadas incorrectamente se conservan para su posterior degradación (Hurtley et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 1989; 5:277-307) .

Determinadas mutaciones en el ADN resultan en sustituciones de aminoácidos que impiden adicionalmente, y en muchos casos se oponen, al plegamiento correcto de las proteínas mutantes. Para corregir estos plegamientos erróneos, los investigadores han intentado utilizar diversas moléculas. Las altas concentraciones de glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO) , trimetilamina-N-óxido (TMAO) , o agua deuterada han demostrado suprimir la vía de degradación y aumentar el tráfico intracelular de la proteína mutante en varias enfermedades (Brown et al., Cell Stress Chaperones 1996; 1:117-125; Burrows et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97:1796-801) . Estos compuestos se consideran chaperones químicos no específicos para mejorar el plegamiento de proteínas en general, aunque el mecanismo de la función es aún desconocido. Las altas dosis de esta clase de compuestos requeridas para la eficacia les hace difícil o inapropiados de utilizar... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la vida útil in vitro de una ß-glucocerebrosidasa de tipo salvaje humana recombinante purificada en una formulación para la administración parenteral a un ser humano, poniendo en contacto la ßglucocerebrosidasa en un soporte farmacéuticamente aceptable con isofagomina en una cantidad eficaz para aumentar la vida útil de la ß-glucocerebrosidasa.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la ß-glucocerebrosidasa, el soporte farmacéuticamente aceptable y la isofagomina se formulan en un polvo liofilizado o en una disolución acuosa estéril.

3. Una composición farmacéutica que comprende una ß-glucocerebrosidasa de tipo salvaje humana recombinante

purificada e isofagomina en un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde la ß-glucocerebrosidasa purificada y 10 la isofagomina están en una formulación que tiene un pH neutro para la administración parenteral a un ser humano.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la formulación es un líquido para la administración intravenosa.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, donde el líquido está a un pH de aproximadamente 7, 0-7, 5.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde la disolución acuosa estéril está a un pH de 15 aproximadamente 7, 0-7, 5.