TRP8, CANAL RECEPTOR DE POTENCIAL TRANSITORIO EXPRESADO EN CELULAS RECEPTORAS GUSTATIVAS.

Procedimiento para identificar un compuesto que induce la percepción de un sabor amargo,

que comprende:

(i) poner en contacto una célula que expresa la proteína de canal receptor de potencial transitorio 8 ("TRP8") con un compuesto de ensayo y medir el nivel de activación de TRP8,

(ii) en un experimento independiente, poner en contacto una célula que expresa la proteína de canal TRP8 con un control de vehículo y medir el nivel de activación de TRP8 bajo condiciones esencialmente iguales a las de la parte (i), y

(iii) comparar el nivel de activación de TRP8 medido en la parte (i) con el nivel de activación de TRP8 medido en la parte (ii),

en el que un nivel incrementado de TRP8 activado en presencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo induce la percepción de un sabor amargo

TRP8, canal receptor de potencial transitorio expresado en células receptoras gustativas.

Introducción

La presente invención se basa en el descubrimiento, identificación y caracterización de un canal receptor de potencial transitorio, denominado en la presente invención TRP8, que se expresa en células receptoras gustativas y que se asocia a la percepción de los sabores amargo y dulce. Los moduladores de la actividad de TRP8 pueden utilizarse como intensificadores del sabor en alimentos, bebidas y compuestos farmacéuticos.

Antecedentes de la invención

Se cree que los mamíferos presentan cinco categorías básicas de percepción del sabor: salado, ácido, dulce, amargo y umami (glutamato monosódico) (para una revisión, ver Lindemann, Physiological Reviews 76:719-766, 1996; Hemess y Gilbertson, Annu. Rev. Physiol. 61:873-900, 1999). Las señales del sabor son detectadas por células especializadas receptoras del sabor (TRCs), que se encuentran organizadas en papilas gustativas. Cada papila gustativa comprende entre aproximadamente 50 y 100 células individuales agrupadas en un conglomerado que presenta un diámetro de entre 20 y 40 micrómetros. Las fibras nerviosas entran en la base de la papila gustativa y forman una sinapsis con algunas de las células receptoras gustativas. Típicamente una única TRC entra en contacto con varias fibras nerviosas sensoriales y cada fibra sensorial innerva varias TRCs en la misma papila gustativa (Lindemann, supra).

Las TRCs de la mayoría, quizá de la totalidad, de las especies de vertebrado, presentan canales iónicos de sodio, potasio y calcio regulados por el voltaje, con propiedades similares a las de las neuronas (Kinnamon, S.C. & Margolskee, R.F., Curr. Opin. Neurobiol. 6:506-513, 1996). Aparentemente, diferentes tipos de sabores primarios utilizan diferentes tipos de mecanismos de transducción, y determinados tipos de sabor pueden utilizar múltiples mecanismos, lo que podría reflejar los diversos requisitos nutricionales de las diferentes especies (Kinnamon & Margolskee, supra).

La transducción de los sabores amargo y dulce se cree que implica AMPc e IP₃ (Kinnamon & Margolskee, supra). El compuesto amargo denatonium provoca la liberación de iones calcio de las TRCs de rata y el rápido incremento de los niveles de IP₃ en tejido gustativo de roedor (Id., citando a Bernhardt, S.J. et al., J. Physiol. (London) 490:325-336, 1996, y Akabas, M.H. et al., Science 242:1047-1050, 1988). Debido a que el denatonium no puede atravesar la membrana celular, se ha sugerido que podría activar receptores acoplados a proteína G y que, como resultado, las subunidades a y/o ß? de la proteína G activarían la fosfolipasa C, conduciendo a la generación de IP₃ y a la liberación de iones calcio (Kinnamon & Margolskee, supra).

En los últimos años se ha clonado y caracterizado una proteína G específica del gusto denominada "gustducina", que es homóloga a la proteína G retiniana (Id., citando a McLaughlin, S. et al., Nature (London) 357:563-569, 1992). Se cree que la gustducina desempeña un papel directo en la transducción tanto del sabor amargo como del sabor dulce. Por ejemplo, los ratones knockout para gustducina y para subunidad de gustducina (%-gustducina) presentaron una menor aversión a los compuestos amargos. Inesperadamente, los ratones también mostraron una preferencia para los compuestos dulces, sugiriendo la implicación de la gustducina en la transducción del sabor dulce.

Algunos experimentos bioquímicos recientes han demostrado que las preparaciones de receptor gustativo activan la transducina y la gustducina en respuesta al denatonium y a otros compuestos amargos (Ming et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8933-8, 1998).

La patente EP nº 1 237 910 B1, derivada de la patente WO nº 01/32693, técnica anterior según el Art. 54(3) y (4) EPC 1973 para los Estados contratantes comúnmente designados, describe secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de MTR1 pertenecientes a la familia de proteínas TRP (receptores de potencial transitorio). Se ha publicado la misma exposición en Prawitt D. et al., Human Molecular Genetics, 9(2):203-216, 2000, que hace referencia al nº de acceso GenBank AF177473.

Con el fin de entender por completo los mecanismos moleculares subyacentes a la sensación del sabor, resulta importante identificar cada componente molecular en las rutas de transducción de la señal del sabor. La presente invención se basa en la clonación de un canal iónico, TRP8 (canal receptor de potencial transitorio 8), que se cree que se encuentra implicado en la transducción del sabor y que podría encontrarse implicado en los cambios de los iones de calcio intracelular asociados a la percepción del sabor amargo.

Descripción de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento, identificación y caracterización de un canal receptor de potencial transitorio (TRP), denominado en lo sucesivo TRP8, que participa en la ruta de transducción de las señales del sabor. TRP8 es una proteína de canal con un elevado grado de similitud estructural con la familia de las proteínas de canal del calcio conocidas como canales receptores de potencial transitorio. Tal como se ha demostrado mediante análisis de transferencia northern, la expresión del transcrito TRP8 se encuentra estrechamente regulada, encontrándose los niveles de expresión génica más altos en el tejido gustativo, una expresión moderada en estómago e intestino delgado, y expresión de nivel muy bajo en útero y testículo. La hibridación in situ indica que la expresión de TRP8 se produce en las papilas circunvaladas y foliáceas, pero no en los epitelios no gustativos circundantes. Además, el patrón general de expresión de TRP8 era comparable al de la a-gustducina, aunque la señal de activación de la gustducina era algo más intensa.

La presente invención se refiere a procedimientos de cribado que utilizan el gen TRP8 y/o productos del gen TRP8 como dianas para la identificación de compuestos que modulan, es decir, que actúan como agonistas o antagonistas, de la actividad y/o expresión de TRP8. Los compuestos que inducen respuestas de sabor que son similares a las inducidas por estimulantes del gusto amargo pueden utilizarse como aditivos para provocar una respuesta deseada de aversión, por ejemplo para desalentar la ingestión por niños o animales de composiciones que contienen dichos compuestos. Los compuestos que inhiben la actividad del canal TRP8 pueden utilizarse para bloquear la percepción de amargor. Los inhibidores de TRP8 pueden utilizarse como intensificadores del sabor en alimentos, bebidas o compuestos farmacéuticos mediante la reducción o eliminación de la percepción del sabor amargo.

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una proteína de canal que se expresa a niveles elevados en células receptoras gustativas. En la transducción del gusto, se cree que los compuestos amargos actúan a través de las proteínas G, tales como la gustducina, que a su vez regula los sistemas de segundo mensajero. La colocalización de a-gustducina, ?-gustducina, fosfolipasa Cß₂ (PLCß₂) y TRP8 en un subconjunto de células receptoras gustativas indica que podrían actuar en la misma ruta de transducción. Se cree que TRP8 responde a la generación de inositol trifosfato(IP₃)/diacilglicerol (DAG) inducida por estimulante del sabor inundando la célula gustativa con calcio extracelular y activando los mensajeros dependientes de calcio situados corriente abajo, llevando a la liberación de transmisores en la sinapsis y a la activación de nervios gustativos aferentes.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente invención, poner en cursiva el nombre de TRP8 indicará el gen TRP8, en contraste con el producto proteína codificado por el mismo, que se indicará con el nombre de TRP8 en ausencia de cursiva. Por ejemplo, "TRP8" indicará el gen TRP8, mientras que "TRP8" indicará el producto proteína del gen TRP8.

Breve descripción del dibujo

Figura 1. Secuencia de nucleótidos del ADNc TRP8 murino codificante de la TRP8 murina.

Figura 2. Secuencia de aminoácidos deducida del canal potencial de receptor transitorio TRP8.

Figura 3A-B. Secuencia de nucleótidos del ADNc TRP8 humano codificante de la TRP8 humana.

Figura 4. Secuencia de aminoácidos deducida del canal receptor de potencial transitorio de la...

1. Procedimiento para identificar un compuesto que induce la percepción de un sabor amargo, que comprende:

(i) poner en contacto una célula que expresa la proteína de canal receptor de potencial transitorio 8 ("TRP8") con un compuesto de ensayo y medir el nivel de activación de TRP8,

(ii) en un experimento independiente, poner en contacto una célula que expresa la proteína de canal TRP8 con un control de vehículo y medir el nivel de activación de TRP8 bajo condiciones esencialmente iguales a las de la parte (i), y

(iii) comparar el nivel de activación de TRP8 medido en la parte (i) con el nivel de activación de TRP8 medido en la parte (ii),

en el que un nivel incrementado de TRP8 activado en presencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo induce la percepción de un sabor amargo.

2. Procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la percepción de un sabor amargo y/o estimula la percepción de un sabor dulce, que comprende:

(i) poner en contacto una célula que expresa una proteína de canal receptor de potencial transitorio 8 ("TRP8") con un compuesto de ensayo en presencia de un agente estimulante del sabor amargo y medir el nivel de activación de TRP8,

(ii) en un experimento independiente, poner en contacto una célula que expresa la proteína de canal TRP8 con un agente estimulante del sabor amargo y medir el nivel de activación de TRP8 bajo condiciones esencialmente iguales a las de la parte (i), y

(iii) comparar el nivel de activación de TRP8 medido en la parte (i) con el nivel de activación de TRP8 medido en la parte (ii),

en el que un nivel reducido de TRP8 activado en presencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo inhibe la percepción de un sabor amargo y/o estimula la percepción de un sabor dulce.