Sustratos para detección cromogénica y métodos de uso en los ensayos y kits de detección.

Un compuesto descrito mediante la siguiente fórmula:**Fórmula**

incluidas las sales del mismo;

e incluidas las dos formas enantioméricas R y S y las mezclas racémicas del mismo;

en el que R1 se elige entre el grupo formado por hidrógeno, halógeno, un grupo alquilo y un grupo arilo; y

en el que R2 se elige entre el grupo formado por hidrógeno, un grupo alquilo y un grupo arilo.

Sustratos para detección cromogénica y métodos de uso en los ensayos y kits de detección ÁMBITO

La presente descripción se refiere a sustratos y procesos para la detección cromogénica y en particular a compuestos dihidrogenofosfato de plrazolllo.

ANTECEDENTES

El diagnóstico de las enfermedades basado en la Interpretación de muestras de tejidos o de células extraídas del organismo del paciente se ha expandido en gran manera durante los últimos años. Además de las técnicas tradicionales de tinción histológica y de los ensayos ¡nmunoquímicos ahora se realizan técnicas "¡n sltu", por ejemplo la hibridación "¡n sltu" y la reacción en cadena de la polimerasa "¡n situ" para facilitar el diagnóstico de los estados patológicos de los humanos. Por lo tanto existe una gran variedad de técnicas que pueden evaluar no solo la morfología celular, sino también la presencia de macromoléculas específicas dentro de las células y de los tejidos.

La detección cromogénica de la fosfatasa alcalina (AP) en un tejido se lleva a cabo por lo general mediante la combinación de un fosfato de naftol AS sustituido y una sal de diazonio. Burstone introdujo esta metodología a finales de la década de los años 1950, véase Burstone, J. Histochem. Cytochem. 6, 322-39, 1958. Esta técnica Implica la liberación del naftol por acción de la AP, que después reacciona con una sal de diazonio para generar un colorante azoico ¡nsoluble, que precipita en el sitio del epítope.

Las técnicas cromogénlcas estaban limitadas debido al número limitado de sustratos cromogénicos, que Imparten diferentes colores y son compatibles con las técnicas ¡nmunohistoquímicas. Por lo tanto, lo que se necesita en la técnica son sustratos cromogénicos que proporcionen nuevos colores para el uso en los ensayos ¡nmunohlstoquímlcos y de hibridación. La adición de los nuevos sustratos cromogénicos permite lograr, por ejemplo, el multlplexado de diferentes dianas, que se identifican por depósitos de diferentes colores, todas ellas pueden Identificarse en un tejido Individual en un solo portaobjetos o placa.

Los compuestos descritos en la técnica anterior difieren de los sustratos aquí descritos en la estructura y en los usos.

En la patente US 4,120,956 A se describen los ásteres y las ester-amidas del ácido 3-alcoximetil- y -alquiltiometil- p¡razoi(5)-ll(t¡ono)(t¡ol)-fosfór¡co (fosfónico), métodos de obtención de tales compuestos y su uso para combatir pestes.

En el documento WO 2007/021966 A1 se describen compuestos de pirazol sustituido por un anillo arilo o heteroarilo como Inhibidores de la actividad de la proteína del choque térmico 90 en una célula y su uso para el tratamiento y la prevención de trastornos de proliferación, por ejemplo del cáncer y de la angiogénesis.

RESUMEN

Aquí se describen las formas de ejecución de sustratos y procesos para la detección cromogénica y en particular los compuestos dihidrogenofosfato de pirazolilo.

La presente descripción no se limita a los compuestos dihidrogenofosfato de pirazolilo concretos. En ciertas formas de ejecución, los compuestos se describen mediante la siguiente fórmula:

O

N

N

R

iL

o

,-OH

'OH

H

Incluidas sus sales; e incluidas las dos formas enantioméricas R y S y las mezclas racémlcas de los mismos.

En algunas formas de ejecución, R^ es hidrógeno, halógeno (p. ej. cloro, flúor, bromo, yodo), un grupo alifático saturado o insaturado de cualquier longitud que se desee, o un grupo arilo de cualquier tamaño que se desee.

En algunas formas de ejecución, R^ es hidrógeno, un grupo alifático saturado o Insaturado de cualquier longitud que se desee, o un grupo arilo de cualquier tamaño que se desee.

Tal como se emplea aquí, el término "alifático" indica los grupos ya conocidos en general como alquilo (p. ej. sustituido o sin sustituir), alquenilo (p. ej. sustituido o sin sustituir), alquinilo (p. ej. sustituido o sin sustituir), alicíclico (p. ej. sustituido o sin sustituir).

Tal como se emplea aquí, el término "alifático sustituido" indica un grupo alifático que tiene cualquier número de átomos de carbono que se desee (p. ej. 100, 80, 75, 50, 40, 30, 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2), en el que por lo menos uno de los átomos de hidrógeno alifático se ha reemplazado por un halógeno (p. ej. cloro, bromo, flúor, yodo), un amino, un hidroxi, un alcoxi, un nitro, un tio, una cetona, un aldehido, un áster, una amida, un grupo alifático inferior, un grupo alifático inferior sustituido o un anillo (arilo, arilo sustituido, cicloalifático o cicloalifático sustituido, etc ).

El término "alquilo" ya es conocido en la técnica e indica grupos alifáticos saturados, que incluyen los grupos alquilo de cadena lineal, los grupos alquilo de cadena ramificada, los grupos cicloalquilo (alicíclicos), los grupos cicloalquilo sustituidos por alquilo y los grupos alquilo sustituidos por cicloalquilo.

El término "alquilo sustituido" ya es conocido en la técnica e indica un resto alquilo que tiene un sustituyente que reemplaza a un átomo de hidrógeno de uno o más átomos de carbono del esqueleto del hidrocarburo. Tales sustituyeles pueden incluir, por ejemplo, alquenilo, alquinilo, halógeno (p. ej. cloro, bromo, flúor, yodo), hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluidos el alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluidos el alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureido), amidino, ¡mino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifiuormetilo, ciano, azido, heterociclilo, alquiladlo, o un resto aromático o heteroaromático.

Tal como se emplea aquí, el término "arilo " indica un anillo aromático individual, por ejemplo un anillo fenilo, o dos o más anillos aromáticos conectados entre sí (p. ej. bisfenilo) o fusionados entre sí (p. ej. naftaleno o antraceno).

Tal como se emplea aquí, el término "sustituido arilo" indica un anillo aromático o un sistema de anillo aromático fusionado, en el que por lo menos uno de los átomos de hidrógeno de un carbono del anillo se ha reemplazado por un halógeno (p. ej. cloro, bromo, flúor, yodo), un amino, un hidroxi, un alcoxi, un nitro, un tio, una cetona, un aldehido, un áster, una amida, un resto alifático inferior, un resto alifático inferior sustituido o un anillo (p. ej. arilo, arilo sustituido, cicloalifático o cicloalifático sustituido). Los ejemplos de tales incluyen, pero no se limitan a: hidroxifenilo y similares.

En algunas formas de ejecución, es hidrógeno.

En algunas formas de ejecución, es CH3.

En algunas formas de ejecución, R^ es

(fenilo)

En algunas formas de ejecución, R^ es hidrógeno.

En algunas formas de ejecución, el compuesto dihidrogenofosfato de pirazolilo es una sal que se puede describir también mediante la siguiente fórmula:

Ri

R2

N

-N

H

O

ss

P-

o

e

o

oO

X

en la que X significa cualquier ion que tenga carga positiva.

En algunas formas de ejecución, X significa dos iones positivos monovalentes cualesquiera (p. ej. 2 Na*, 2 K*, 2 NH/, etc ).

En algunas formas de ejecución, X es cualquier ion positivo divalente (p. ej. Mg^*).

En algunas formas de ejecución, el compuesto dihidrogenofosfato de pirazolilo es el dihidrogenofosfato de 3-metil-1- fenil-1H-p¡razol-5-¡lo:

incluidas sus sales; e incluidas las dos formas enantioméricas R y S y las mezclas racémicas de los mismos.

En algunas formas de ejecución, el compuesto es un sustrato para una fosfatasa. En algunas formas de ejecución, el compuesto forma un precipitado de color dorado o amarillo en presencia de una fosfatasa y una sal de diazonio. En algunas formas de ejecución, la sal de diazonio es el tetraclorocincato de 4-(benzo¡lam¡no)-2,5- dietoxibencenodiazonio (Fast Blue BB).

Se describen formas de ejecución de kits que contienen un compuesto descrito en párrafos anteriores y una sal de diazonio. En algunas formas de ejecución, los kits contienen además una enzima que reacciona con dicho compuesto. En algunas formas de ejecución, la enzima es una... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto descrito mediante la siguiente fórmula:

N

R

H

incluidas las sales del mismo; e Incluidas las dos formas enantiomérlcas R y S y las mezclas racémicas del mismo; en el que se elige entre el grupo formado por hidrógeno, halógeno, un grupo alquilo y un grupo arilo; y en el que se elige entre el grupo formado por hidrógeno, un grupo alquilo y un grupo arilo.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho halógeno se elige entre el grupo formado por cloro, flúor, bromo e yodo.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^ es CH3, o en el que R^ es fenllo.

4. El compuesto de la reivindicación 1, dicho compuesto se describe mediante la siguiente fórmula:

en la que X es dos cationes monovalentes o un catión divalente.

5. El compuesto de la reivindicación 4, en el que dicho catión monovalente se elige entre el grupo formado por hidrógeno, Na*, K* o NH4*, o en el que dicho catión divalente es el Mg^*.

6. Un kit que contiene el compuesto de la reivindicación 1; y una sal de diazonio.

7. El kit de la reivindicación 6, que contiene además una enzima que descompone catalíticamente dicho compuesto, opcionalmente en el que dicha enzima es una fosfatasa.

8. El kit de la reivindicación 7, en el que dicha enzima está conjugada con un hapteno, o con una proteína que se fija sobre un antígeno, o con un ácido nucleico.

9. El kit de la reivindicación 8, en el que dicha proteína que se fija sobre un antígeno es una proteína anti-hapteno que se fija sobre un antígeno.

10. Un método de detección de una diana en una muestra biológica que consiste en: poner en contacto dicha muestra con un reactivo de detección que contiene una fosfatasa, que descompone catalíticamente al compuesto según la reivindicación 1, dicho reactivo de detección se une directa o indirectamente a dicha diana, y una sal de diazonio, dicha fosfatasa descompone dicho compuesto en presencia de dicha sal de diazonio para producir un compuesto coloreado; y detectar la presencia de dicho compuesto coloreado.

11. El kit de la reivindicación 6, o el método de la reivindicación 10, en los que dicha sal de diazonio es el tetraclorocincato de 4-(benzoilam¡no)-2,5-d¡etox¡bencenodiazon¡o (Fast Blue BB).

12. El método de la reivindicación 10, en el que dicha diana es un ácido nucleico o una proteína.

13. El método de la reivindicación 10, en el que dicho reactivo de detección contiene un primer reactivo de unión conjugado con dicha fosfatasa.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicho primer reactivo de unión se elige entre el grupo formado por una proteína que se fija sobre un antígeno, un ácido nucleico y un hapteno.

H

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicho reactivo de detección contiene una fosfatasa conjugada con un ácido nucleico, dicha diana es un ácido nucleico y dicho reactivo de detección se híbrida con dicha diana, o en el que dicho reactivo de detección contiene una fosfatasa conjugada con una proteína que se fija sobre un antígeno, dicha

5 diana es una proteína y dicho reactivo de detección se une a dicha diana.

16. El método de la reivindicación 14, en el que dicho reactivo de detección se une indirectamente a dicha diana y dicho reactivo de detección contiene una fosfatasa conjugada con una proteína que se fija sobre un antígeno específico de un hapteno.

17. El compuesto de la reivindicación 1, o el kit de la reivindicación 6, o el método de la reivindicación 10, en los que dicho compuesto es:

p-OH

^OH