Procedimiento de secuenciación de ADN mediante hibridación.

Procedimiento para la determinación de una secuencia de ácido nucleico,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) desnaturalizar una molécula de ácido nucleico bicatenario que corresponde a dicha secuencia de ácido nucleico aplicando una fuerza física a dicha molécula; en el que dicha molécula de ácido nucleico bicatenario es una horquilla, y en el que uno de los extremos del ácido nucleico bicatenario está fijado directa o indirectamente a un soporte, y en el que el otro extremo del ácido nucleico bicatenario está fijado a un soporte móvil;

b) proporcionar una molécula de ácido nucleico monocatenario;

c) renaturalizar dicha molécula de ácido nucleico bicatenario en presencia de dicha molécula de ácido nucleico monocatenario; y

d) detectar un bloqueo de la renaturalización del ácido nucleico bicatenario, comprendiendo dicha determinación las etapas de:

- medir la distancia (z) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están fijados al soporte;

- medir la distancia (zhigh) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están fijados al soporte, cuando dicha molécula de ácido nucleico bicatenario se desnaturaliza; y

- comparar z y zhigh, y

- determinar la posición de la pausa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/058669.

Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS).

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 3, RUE MICHEL ANGE 75016 PARIS FRANCIA.

Inventor/es: BENSIMON, DAVID, CROQUETTE,VINCENT, ALLEMAND,JEAN-FRANÇOIS, MANOSAS,MARIA, DING,FANG-YUAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2542429_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento de secuenciación de ADN mediante hibridación.

La presente invención se refiere a un procedimiento rápido para determinar una secuencia de un ácido nucleico, ADN o ARN, que es útil, particularmente, para secuenciar un ácido nucleico desconocido o, alternativamente para la detección de una secuencia de ácido nucleico específica para diagnóstico.

Actualmente la determinación de una secuencia de ácido nucleico se encuentra en el centro de la biología molecular. Por ejemplo, una amplia gama de los fenómenos biológicos pueden evaluarse mediante una secuenciación del ADN con alta capacidad de procesamiento, por ejemplo, la variación genética, la expresión del ARN las Interacciones ADN-proteicas y la conformación cromosomica (véanse como algunos ejemplos Mltreva & Mardis, Mei/iods Mo/B/o/., 533:153-87, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4):40, 2009; Cloonan et al., /Vaf Mef/?ods, 5(7): 613-619, 2008; Valouev et al., Genome Res., 18(7):1051-63, 2008, Valouev et al., /Vaf Mef/?ods., 5(9):829-34, 2008; Orscheln et al., C//n Mecí D/s., 49(4):536-42, 2009; Walter et al., Proc /Vaf/Acad Se/ USA., 106(31):12950-5, 2009; Mardis et al., /V Eng/J Med., 361 (11): 1058-66, 2009, Hutchinson, /Vuc/. Ac/ds Pes., 35(18): 6227-6237, 2007).

Además la demostración específica de ADN en una muestra fisiológica constituye, actualmente, la línea más importante del desarrollo de procedimientos diagnósticos, por ejemplo, para Identificar la probabilidad de las bacterias para el desarrollo de resistencia a los antibióticos, anormalidades genéticas, los riesgos de cáncer asociados con modificaciones genéticas y las Infecciones víricas, por ejemplo, Infecciones asociadas con el HIV o con varios virus de la hepatitis (véase, por ejemplo, Zhang et al., /Vaiare, 358: 591-593, 1992; Turner et al., J Sacter/o/, 176(12):3708-3722, 1994; Weston et al., Mecí/on and/mman/íy., 77(7): 2840-2848, 2009).

La secuenciación de los ácidos nucleicos se lleva a cabo actualmente, de forma principal, mediante aplicaciones semiautomatizadas basadas capllarmente en la bioquímica de Sanger. El procedimiento clásico incluye una etapa amplificadora del ADN de interés, seguido por una de "secuenciación cíclica", en la que cada ronda de extensión del cebador, finaliza estocásticamente por la Incorporación de dldeoxlnucleótldos marcados fluorescentemente (ddNTP). La secuencia se determina mediante separación electroforétlca de alta resolución de los productos de extensión monocatenarios señalizados en su extremo, en un gel polimèrico basado capllarmente. La electroforesis simultánea en 96 o 384 capilares Independientes proporciona un nivel limitado de paralelización.

La alta demanda de secuenciación de bajo coste ha concitado el desarrollo de tecnologías de secuenciación de alta capacidad de procesamiento que paralellzan el proceso de secuenciación que da lugar a miles de millones de secuencias a la vez (Shendure & Ji, /Vaf B/ofec/rrro/., 26(10):1135-45, 2008). Las tecnologías de secuenciación de alto procesamiento pretenden disminuir el costo de la secuenciación del ADN más allá de lo que es posible con los procedimientos estándares de terminador colorante. Actualmente, esta alta capacidad de procesamiento, se alcanza con sacrificios sustanciales en la longitud y seguridad de las lecturas individuales cuando se comparan con la secuenciación de Sanger. Ejemplos de dichos nuevos procedimientos incluyen las tecnologías 454 y la Solexa. Estas tecnologías permiten la secuenciación de bibliotecas génicas de genomas enteros sin clonar en E. Coli o en cualquier célula huésped. Bibliotecas de fragmentos cortos de ADN flanqueados por adaptadores, capturados en la superficie de perlas, se amplifican mediante PCR de emulsión. La secuenciación se lleva a cabo utilizando la síntesis mediada por la ADN polimerasa. En el procedimiento 454 (conocido también como "pirosecuenciación"), la variedad se presenta con cada uno de los cuatro dNTPs, secuencialmente, y la cantidad incorporada se monitoriza mediante detección luminométrica del pirofosfato liberado. Una diferencia clara entre este procedimiento y el de Solexa, es que éste utiliza nucleótidos al final de la cadena. La señalización fluorescente en la base final puede eliminarse para dejar un extremo 3' desbloqueado, haciendo que la finalización de la cadena sea un proceso reversible. La tecnología SOLiD se basa en la unión de las sondas dibásicas señalizadas fluorescentemente a un cebador secuenciador hibridado a una secuencia adaptadora dentro del molde clonalmente amplificado de la biblioteca. La especificidad de la sonda dibàsica se obtiene informándose de cada 1" y 2" base en cada reacción de unión. Ciclos múltiples de unión, detección y fragmentación, se llevan a cabo con el número de ciclos que determina la longitud eventual de lectura. En contraste con las 3 tecnologías previas, las cuales requieren todas una primera etapa de amplificación, la plataforma Helicos permite la secuenciación de moléculas únicas de ADN. Esta tecnología se basa en la utilización de un sistema de detección muy sensible de la incorporación de nucleótidos fluorescentes para Interrogar directamente a las moléculas únicas del ADN mediante secuenciación por síntesis.

Dichos procedimientos se describen en, por ejemplo, la patente US n° 4.882.127, patente US n° 4.849.077; patente US n° 7.556.922; patente US n° 6.723.513; solicitud de patente PCT n° WO 03/066896; solicitud de patente PCT n° W02007111924; solicitud de patente US n° 2008/0020392; solicitud de patente PCT n° WO 2006/084132; solicitud de patente U S. No. US 2009/0186349; solicitud de patente US n° US 2009/0181860; solicitud de patente US n° 2009/0181385; solicitud de patente n° US 2006/0275782; patente europea EP-B1-1141399; Shendure & Ji, /Vaf B/oíecñno/., 26(10):1135-45. 2008; Pihlak et al., /Vaf B/ofec/irro/., 26(6): 676-684, 2008; Fuller et al., /Vaiare B/oíecñno/., 27 (11): 1013-1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40-2009; Metzker, /Vaiare Pev. Genef., 11(1): 31-46, 2010. En particular, la solicitud de PCT WO 2010/016937 proporciona un procedimiento para determinar la secuencia de un ácido nucleico sometido a una fuerza.

Sin embargo, todos los procedimientos que se han desarrollado por el momento presentan serlos Inconvenientes. En particular, todos utilizan nucleótidos señalizados (por ejemplo fluorescentes) contribuyendo así a aumentar seriamente los costes totales. Además, todos estos nuevos procedimientos no funcionan (la plataforma Helicos) requiere amplificación de la secuencia diana antes de la secuenclaclón, lo que, por una parte, emplea tiempo, y por otra, aumenta la probabilidad de errores y es altamente propenso a la contaminación. Los procedimientos de la presente Invención se definen en las reivindicaciones añadidas 1-21. El procedimiento según la presente invención, que se basa en las técnicas físicas y en tratamientos electrónicos, difiere de los enfoques habituales, que son químicos o bioquímicos. Sus ventajas son numerosas:

1) Permite la secuenclaclón de una molécula única y por tanto no requiere una etapa previa de amplificación (por ejemplo, mediante PCR).

2) Es mucho más barato que los procedimientos de la técnica, ya que se utilizan moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios, que son mucho menos caros que los nucleótidos señalizados (con fluoróforos o algunos otros grupos). Además la cantidad de las moléculas ácido nucleicas monocatenarlas estándar se reduce a un mínimo ya que la secuencia de una molécula de ácido nucleico bicatenario única está determinada. Además en algunas formas de realización por lo menos, las cadenas de sondeo pudieran reutlllzarse, pues no se consumen en el proceso de secuenclaclón.

3) Permite determinar la localización (en pares de bases) de una molécula de ácido nucleico monocatenarlo emparejada a lo largo de un ácido nucleico bicatenario, midiendo la distancia entre los dos extremos de dicha molécula de ácido nucleico bicatenario.

4) Permite determinar, en un ensayo de renaturallzaclón las distintas posiciones de hibridación de un ollgonucleótido sobre una horquilla de un ácido nucleico bicatenario dado.

5) La medición puede repetirse periódicamente en una segunda escala de tiempo, llevando de este modo a la eliminación de positivos falsos (hibridaciones falsas parciales), a estadísticas mejoradas, permitiendo una reducción significativa en derivas instrumentales.

6) El experimento puede repetirse muchas veces sobre Idéntica molécula, mejorando de esta forma las estadísticas y la solvencia de la medición, ya que el ácido nucleico monocatenario hibridado puede sufrir eyección (por ejemplo, reduciendo la fuerza o la fuerza Iónica o utilizando una helicasa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la determinación de una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) desnaturalizar una molécula de ácido nucleico bicatenario que corresponde a dicha secuencia de ácido nucleico aplicando una fuerza física a dicha molécula; en el que dicha molécula de ácido nucleico bicatenario es una horquilla, y en el que uno de los extremos del ácido nucleico bicatenario está fijado directa o indirectamente a un soporte, y en el que el otro extremo del ácido nucleico bicatenario está fijado a un soporte móvil;

b) proporcionar una molécula de ácido nucleico monocatenario;

c) renaturalizar dicha molécula de ácido nucleico bicatenario en presencia de dicha molécula de ácido nucleico monocatenario; y

d) detectar un bloqueo de la renaturalización del ácido nucleico bicatenario, comprendiendo dicha determinación las etapas de:

- medir la distancia (z) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están fijados al soporte;

- medir la distancia (zhigh) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están fijados al soporte, cuando dicha molécula de ácido nucleico bicatenario se desnaturaliza; y

- comparar z y zhigh, y

- determinar la posición de la pausa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico bicatenario se desnaturaliza en la etapa a) alejando los soportes.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que una fuerza física superior o igual a 15 pN, preferentemente superior o igual a 17 pN, más preferentemente superior o igual a 18 pN, se aplica a la molécula bicatenaria alejando

los soportes.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico bicatenario desnaturalizado se renaturaliza en la etapa (c) uniendo los soportes.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la fuerza aplicada a la molécula bicatenaria se reduce a menos de o igual a 12 pN, preferentemente menos de o igual a 11 pN, más preferentemente menos de o igual a 10 pN, uniendo los soportes.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los extremos del ácido nucleico bicatenario que no están fijados a un soporte, se unen a otro covalente o no covalentemente.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas a) a d) se repiten varias veces, de manera que se acumulen mediciones y aumente la relación señal/ruido.

8. Procedimiento según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, que comprende una etapa adicional de medir la duración del bloqueo.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, que comprende una etapa adicional de comparar la duración del bloqueo con un valor de referencia.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de ácido nucleico monocatenario se selecciona de entre una biblioteca de las moléculas de ácido nucleico monocatenario n-mer, consistiendo dicha biblioteca en la totalidad de combinaciones posibles de di- o trinucleótidos unidos con la totalidad de combinaciones posibles de n-2 o n-3 nucleótidos, siendo n respectivamente un entero preferentemente inferior o igual a 30.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el di- o trinucleótido está ubicado en el centro de la molécula de ácido nucleico monocatenario.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el di- o trinucleótido está ubicado excéntrico de la molécula

de ácido nucleico monocatenario.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que cada presencia en el ácido nucleico bicatenario de por lo menos una de las 4 bases adenina, citosina, guanina y timidina, es reemplazada por un marcador de aumento específico, siendo dicho marcador de aumento un oligonucleótido.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el ácido nucleico monocatenario es un oligonucleótido complementario a uno de los marcadores de aumento.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 que comprende una etapa adicional de determinar cada posición de bloqueo para dicho ácido nucleico monocatenario sobre la molécula de ácido nucleico bicatenario.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que las etapas a) a d), y la etapa adicional de determinar cada posición de bloqueo para el ácido nucleico monocatenario sobre la molécula de ácido nucleico bicatenario, se repiten sucesivamente con cada uno de los oligonucleótidos complementarios a los marcadores de aumento.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende las etapas adicionales de:

i) ligar a un cebador de ácido nucleico monocatenario en dirección hacia 5' un ácido nucleico monocatenario hibridado adyacente, y

¡i) monitorizar la extensión de dicho cebador:

a desnaturalizando y renaturalizando dicho ácido nucleico bicatenario en presencia de dicho cebador ligado,

y

p detectando un bloqueo en la renaturalización.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que las etapas (i) a (¡i) se repiten con un ácido nucleico monocatenario diferente.

19. Procedimiento según las reivindicaciones 17 y 18, en el que la molécula de ácido nucleico monocatenario se selecciona de entre una biblioteca de moléculas de ácido nucleico monocatenario n-mer, consistiendo dicha biblioteca en la totalidad de combinaciones posibles de dinucleótidos unidos en su extremo 3' a la totalidad de combinaciones posibles de los n-2 nucleótidos, siendo n un entero, preferentemente inferior o igual a 20.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la cadena recién sintetizada es eyectada o desensamblada.

21. Procedimiento para la determinación de una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que las etapas i) e ¡i) según la reivindicación 17 se repiten con un cebador que se desplaza hacia 5' o hacia 3' mediante un nucleótido con respecto al cebador según la reivindicación 17.


 

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