Secuencia de ADN artificial con función líder optimizada en 5'' (5''-UTR) para la expresión mejorada de proteínas heterólogas en plantas.

ADN artificial de una región líder 5'-UTR adecuado para mejorar la expresión de proteínas heterólogas en plantas,

que tiene elementos favorables a la expresión génica, que comprende una única copia del octámero ACAATTAC asociado con al menos una región poli(CAA), que comprende 9 repeticiones de CAA situadas en posición 5' con respecto al octámero y en combinación con al menos una región poli(CT) que comprende un elemento (CT)4 añadido al extremo 3' del elemento regulador obtenido a partir de la unión del octámero ACAATTAC con la región poli(CAA).

Secuencia de ADN artificial con función líder optimizada en 5 (5-UTR) para la expresión mejorada de proteínas heterólogas en plantas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una secuencia de ADN artificial para mejorar la expresión de proteínas heterólogas en plantas.

Antecedentes de la invención

En el campo de la biotecnología existe una fuerte necesidad de potenciar el nivel de expresión de genes introducidos en los organismos relativos. Este nivel a menudo es insatisfactorio y representa una barrera para la aplicación industrial de innovaciones en la biotecnología de plantas y animales. Existe una cantidad de datos que avalan la importancia de la región líder en la regulación de los niveles de expresión génica, mientras que hay varios elementos estructurales que caracterizan la capacidad de regulación de los mismos.

En este caso, la secuencia líder no traducida en 5' (5'-UTR), como se propone en vectores ampliamente difundidos (por ejemplo, pB1121 y derivados, pCAMBIA y derivados), tiene numerosos defectos que la convierten en inadecuada para dirigir niveles adecuados de expresión génica en organismos modificados genéticamente. En particular, cuando se han de aumentar al máximo los rendimientos (por ejemplo, el uso de plantas como fábricas de células para compuestos útiles para el ser humano), es necesario eliminar las restricciones de la producción ejercidas por la secuencia 5'-UTR. Con este fin, se ha propuesto un líder O (una secuencia que existe de forma natural en el virus del mosaico del tabaco, TMV) en plantas. No obstante, esto también tiene imperfecciones y redundancias, por lo que caben mejoras.

Se sabe que la región poli(CAA) en el potenciador de la traducción presente en la líder O del TMV (Gallie y Walbot 1992 Nucleic Acids Res., 2, 4631-4638) potencia significativamente los niveles de expresión, es decir, tiene un efecto positivo sobre los niveles de traducción de proteínas heterólogas in vitro e in vivo (Gallie et al. 1988a Nucleic Acids Res., 16, 883-893, Gallie et al. 1988b Nucleic Acids Res., 16, 8675-8694, Gallie 22 Nucleic Acids Res., 3, 341 -3411). La región líder ü, una secuencia de poli(CAA) se asocia con 3 repeticiones de la secuencia ACAATTAC (Gallie et al. 1988a), pero en estudios de detección se ha demostrado que el elemento regulador responsable de potenciar los niveles de expresión puede consistir en una sola copia de la secuencia ACAATTAC en combinación con el motivo (CAA)n (Gallie y Walbot 1992).

También se sabe que el sitio de iniciación de la transcripción (In/) del promotor 35S de CaMV (Guilley et al. 1982 Cell, 3, 763-773) favorece una protección eficiente en los extremos del ARNm.

Adicionalmente, se sabe que muchos líderes vegetales (Bolle et al. 1996 Plant Mol. Biol. 32, 861-868) tienen una secuencia rica en elementos CT y que las secuencias ricas en TC pueden alterar los niveles de transcripción (Chen et al. 1996 J. Viral., 7, 8411 -8421).

Se sabe que las secuencias que tienen una longitud de más de 4 nucleótidos estimulan el reconocimiento del primer AUG como auténtico codón inicial de la traducción (Kozak 1989 J. Cell. Biol., 18, 229-241). Por ejemplo, se ha observado que la extensión del líder de 29 a 74 nt produce un incremento del nivel de traducción del ARNm in vitro (Kozak 1991, J. Biol. Chem., 266, 19867-1987) e in vivo (Gallie y Walbot 1992). No se recomiendan las secuencias líder con un mayor contenido de A/T producen niveles de expresión más altos, ya que la formación de segmentos de ARNm bicatenario, debido al plegamiento de la molécula sobre sí misma. De hecho, es cierto que dichas estructuras secundarias tienen un efecto depresor sobre la eficiencia de la traducción (Pelletier y Sonenberg 1985 Cell, 4, 515-526; Kozak 1986 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 285-2854). Además, se ha observado que la introducción de porciones de 5'-UTR d e origen viral en líderes vegetales se puede reflejar en un incremento de los niveles de expresión de las proteínas indicadoras (Dowson Day et al. 1993 Plant Mol. Biol., 23, 97-19).

El propósito de la presente invención es obviar los inconvenientes del estado de la técnica y conseguir una secuencia líder que aumente los niveles de expresión de las proteínas recombinantes en plantas.

El solicitante ha concebido, probado y plasmado la presente invención para superar los inconvenientes del estado de la técnica y obtener estos y otros propósitos y ventajas.

Sumario de la invención

La presente invención se expone y caracteriza en las reivindicaciones independientes, mientras que las reivindicaciones dependientes describen otras características de la invención o variantes de la idea principal de la invención.

De acuerdo con el propósito anterior, una secuencia de ADN artificial que tiene una función líder en 5' (5'-UTR), en lo sucesivo en el presente documento indicada por LL-TCK, se acuerdo con la presente invención comprende de forma simultánea elementos favorables a la expresión génica, tal como elementos de tres nucleótidos repetidos CAA en

combinación con elementos dinucleotídicos repetidos CT.

La secuencia LL-TCK de acuerdo con la presente invención se obtuvo por medio de síntesis artificial y es el fruto del intelecto, ya que no existe en la naturaleza.

La secuencia LL-TCK de acuerdo con la presente invención proporciona la combinación de elementos trinucleotídicos CAA con elementos dinucleotídicos CT y una modificación de las secuencias que activan la traducción presente en el líder ü.

La secuencia de acuerdo con la presente invención contiene una región poli(CAA), es decir, un oligonucleótido que consiste en 9 o más copias del elemento CAA, preferentemente, aunque no necesariamente, contiguas entre sí.

La secuencia de acuerdo con la presente invención contiene una región poli(CT), es decir, un oligonucleótido que consiste en 4 o más copias del elemento CT, preferentemente, aunque no necesariamente, contiguas entre sí.

La presente invención proporciona que la secuencia contiene una o más copias del octámero ACAATTAC.

Una secuencia obtenida de la combinación de las secuencias con una región poli(CAA) y de aquellas con una región poli(CT) también entran en el campo de la presente divulgación.

Una secuencia obtenida de la combinación de las secuencias con una región poli(CAA) y de aquellas con una o más copias del octámero ACAATTACC también entran en el campo de la presente divulgación.

Adicionalmente, una secuencia obtenida de la combinación de las secuencias con una región poli(CT) y de aquellas con una o más copias del octámero ACAATTACC también entran en el campo de la presente divulgación.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una secuencia obtenida de la combinación de las secuencias con una región poli(CAA), aquellas con una región poli(CT) y aquellas con una o más copias del octámero ACAATTACC. Adicionalmente, de nuevo de acuerdo con la presente divulgación, es posible proporcionar una secuencia obtenida de la combinación de una o más de las secuencias anteriores con el sitio Inr de 35S de CaMV, es decir, el sitio de iniciación de la transcripción del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.

La secuencia LL-TCK de acuerdo con la presente invención es, por tanto, capaz de incrementar los niveles de expresión de las proteínas heterólogas en plantas transgénicas. De acuerdo con una solución ventajosa de la presente invención, la nueva secuencia LL-TCK se sintetizó para crear una combinación de los elementos siguientes de acuerdo con un patrón original, único de su tipo:

(1) sitio de iniciación de la transcripción (Inr) del promotor 35S del CaMV para una protección eficiente de los extremos del ARNm;

(2) región poli(CAA) similar al potenciador de la transcripción presente en el líder O del TMV;

(3) una secuencia rica en elementos CT, como muchas líderes vegetales.

Adicionalmente, la secuencia LL-TCK tiene una longitud de más de 4 nucleótidos con el fin de estimular el reconocimiento del primer AUG como el auténtico codón de iniciación de la traducción (Kozak 1989) y un contenido global de G+C de menos del 4 %.

De acuerdo con la solución concreta de la presente invención, la secuencia LL-TCK es la que se muestra en la SEC ID N21 (5'-3').

Es posible prever que las mutaciones pequeñas en la secuencia LL-TCK no alteren su eficacia y, por esta razón, la presente divulgación también se refiere a secuencias líder derivadas de la presente secuencia, por ejemplo tras deleción o duplicación de un triplete CAA, sustitución o deleción de una única base, etc.

La innovación de LL-TCK... [Seguir leyendo]

1. ADN artificial de una región líder 5'-UTR adecuado para mejorar la expresión de proteínas heterólogas en plantas, que tiene elementos favorables a la expresión génica, que comprende una única copia del octámero ACAATTAC asociado con al menos una región poli(CAA), que comprende 9 repeticiones de CAA situadas en posición 5' con respecto al octámero y en combinación con al menos una región poli(CT) que comprende un elemento (CT)4 añadido al extremo 3' del elemento regulador obtenido a partir de la unión del octámero ACAATTAC con la región poli(CAA).

2. ADN artificial de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una combinación de dicho ADN artificial con el sitio Inrde 35S del CaMV, es decir, el sitio de iniciación de la transcripción del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.

3. ADN artificial de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la secuencia mostrada en la SEC ID N21.

4. ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende secuencias complementarias a las indicadas en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una longitud comprendida entre 4 y 15 nucleótidos.

6. ADN Artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene un contenido de G+C de menos del 6 %, preferentemente de menos del 5 %.

7. ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en cuanto a que se puede obtener a

partir de:

a) síntesis artificial; b) procesos de recombinación naturales o inducidos dentro de secuencias naturales o artificiales.

8. Una construcción dentro de vectores de expresión vegetales de 5'-UTR, que comprende un ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores presente en la región 5'-UTR.

9. Cepas bacterianas portadoras de plásmidos que contienen el ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con referencia particular a la especie Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens y Agrobacteríum rhizogenes.

1. Cepas de virus modificados genéticamente que contienen el ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con independencia del organismo huésped.

11. Células vegetales transformadas de forma estable con vectores de expresión que contienen el ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 bajo el control de un promotor seleccionado de un grupo que comprende: un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido y en particular específico de la semilla, un promotor inducible, un promotor con actividad transcripcional dependiente de la fase, un promotor activo en el cloroplasto, un promotor activo en la mitocondña.

12. Plantas transformadas de forma estable con vectores de expresión que contienen el ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizadas por la expresión transitoria de cualquier proteína en la que el ARN mensajero contiene dicha región líder en 5'-UTR, entendiéndose que la expresión transitoria significa la producción de dicha proteína por medio de vectores virales, agroinfiltración, liberación de partículas, electroporación.

13. Plantas o progenies de la misma, transformadas de manera estable con vectores de expresión que contienen el ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Uso del ADN artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la producción biotecnológica de moléculas o para la síntesis de:

- proteínas recombinantes;

- proteínas recombinantes destinadas a inducir resistencia a patógenos víricos, bacterianos o fúngicos;

- proteínas recombinantes destinadas a inducir resistencia a herbicidas;

-proteínas recombinantes destinadas a obtener una composición modificada en ácidos grasos en el material bruto y productos que derivan de las mismas;

-proteínas recombinantes destinadas a obtener un valor nutricional modificado del material bruto y de los productos que derivan de las mismas;

- proteínas recombinantes destinadas a la producción de combustibles, gomas y bioplásticos;

- enzimas industriales y proteínas comerciales;

- proteínas farmacéuticas;

- vacunas administradas por vía oral, destinadas para el ser humano o los animales;

- vacunas inyectables, destinadas para el ser humano o los animales;

- vacunas inyectables específicas del paciente, preferentemente específicas de idiotipo, para su uso en el

tratamiento de tumores del sistema linfático;

- proteínas implicadas en la producción de metabolitos secundarios;

- proteínas utilizables directamente o indirectamente como factores para identificar y/o seleccionar células transformadas.