Reprogramación episómica con compuestos químicos.

Un método in vitro para producir una población de células iPS humanas capaces de diferenciarse hasta células o tejidos completamente diferenciados,

en el que las células iPS están sustancialmente exentas de elementos genéticos exógenos, que comprende:

a) obtener células somáticas que comprenden un elemento genético extracromosómico que expresa uno o más factores de reprogramación;

b) cultivar las células somáticas y las células de la progenie de las mismas en una condición de reprogramación que comprende el inhibidor de GSK-3 añadido externamente y al menos uno de inhibidor de MEK, e inhibidor de receptores de TGF-β, por lo que se produce una población de células iPS; y

c) expandir la población de células iPS en una condición de expansión que tiene un medio de expansión básicamente exento de inhibidor de GSK-3, inhibidor de MEK, e inhibidor de receptores de TGF-β añadidos externamente.

Reprogramación episómica con compuestos químicos

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo del desarrollo de células madre. Más en particular, se refiere a la generación de células madre pluripotentes.

2. Descripción de la técnica relacionada

La capacidad de proliferación ¡limitada y la capacidad pluripotente de las células madre embrionarias (ES) humanas ha ofrecido un acceso sin precedentes a todos los tipos de células del cuerpo humano. Las células madre pluripotentes inducidas (¡PS) humanas obtenidas directamente de células somáticas de pacientes con un trasfondo genético deseado comparten estas dos propiedades clave de las células ES humanas, lo que hace que estas células sean candidatos excelentes para modelos de enfermedades, cribado de fármacos, ensayos de toxicidad y terapias de transplantes. La obtención inicial de células ¡PS humanas empleó vectores retrovirales o lentivirales con integración en el genoma para administrar transgenes de reprogramación (Lowry et al., 28; Park ef al., 28; Takahashi et al., 27; Yu et al., 27). Tales vectores pueden producir mutaciones por inserción que interfieren con las funciones normales de las células iPS humanas y sus derivados, y la expresión de transgenes residuales que puede influir en la diferenciación hasta linajes específicos (Yu ef al., 27), o incluso dar como resultado la tumorigénesis (Okita etal., 27).

Se han obtenido células iPS exentas de elementos genéticos exógenos a partir de fibroblastos embrionarios de ratón con transfecciones repetidas de plásmidos (Okita et al., 28), a partir de células hepáticas de ratón y fibroblastos humanos con vectores adenovirales sin integración (Stadtfeld ef al., 28; Zhou y Freed, 29), a partir de células somáticas con transposones PiggyBac (Woltjen ef al., 29), a partir de fibroblastos humanos con vectores episómicos basados en oriP/EBNA-1 (Yu ef al., 29), y la transducción de proteínas. A pesar de estos rápidos avances, ciertos obstáculos importantes siguen impidiendo el uso generalizado de una tecnología simple que produzca células iPS humanas de elevada calidad exentas de elementos genéticos exógenos. Por ejemplo, todas las tecnologías actuales (excepto la aproximación mediante el transposón PiggyBac) que permiten la generación de células iPS humanas exentas de elementos genéticos exógenos proporcionaron una eficacia de reprogramación muy baja. Esta baja eficacia hace difícil obtener células iPS de manera consistente a partir de una diversidad de tipos de células somáticas humanas fácilmente accesibles, y a partir de células con un trasfondo genético y edad del donante diferentes. La aproximación del transposón PiggyBac ofrece una eficacia de reprogramación razonable. Sin embargo, la eliminación de transposones de las células iPS puede ser bastante laboriosa cuando están implicadas muchas líneas celulares donantes.

Además, a pesar de la similitud elevada de las células iPS humanas con las células ES humanas, existen variaciones significativas clon a clon tanto en la expresión genética/modificaciones epigenéticas como en la capacidad de diferenciación específica del linaje de las células iPS humanas. En particular, en comparación con las células ES humanas, la mayoría de las células iPS humanas exhiben una capacidad de diferenciación neuronal significativamente inferior y ninguna respuesta a LIF (factor inhibidor de leucemia), que mantiene de manera rutinaria el cultivo de las células ES de ratón. Además, debido a la ausencia de buenos marcadores fácilmente ensayables para las células iPS humanas de calidad elevada, la selección del clon de células iPS humanas de calidad elevada puede ser laboriosa y requerir mucho tiempo.

La reprogramación genética de las células somáticas humanas hasta células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) podría ofrecer fuentes renovables de células para terapias de transplantes. Para cumplir la promesa, las iPSCs humanas se obtendrán y se cultivarán de manera ideal en medios químicamente definidos exentos de células de soporte, y estarán exentas de ADN exógeno (sin huellas). Actualmente, no existe un método no viral exento de células de soporte simple y eficaz para la generación de iPSCs humanas sin huellas. Previamente, los esfuerzos para obtener iPSCs humanas sin huellas empleando vectores episómicos para la administración de transgenes fueron ineficaces y requirieron células de soporte.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de abordar la ineficacia u otros problemas en la preparación de células madre pluripotentes inducidas básicamente exentas de componentes genéticos exógenos.

Compendio de la invención

Los aspectos de la presente invención superan una deficiencia importante de la técnica, proporcionando métodos nuevos para la preparación de células madre pluripotentes inducidas básicamente exentas de elementos de vectores exógenos, y así proporcionan ventajas particulares en cuanto a las aplicaciones de las células iPS.

Además, mediante el uso de moléculas pequeñas, ciertos aspectos ejemplares de la presente invención mejoraron enormemente la eficacia de la reprogramación episómica (>7 veces; >3 veces si se usa MYC deficiente de transformación, tal como LMYC), y establecieron una condición de reprogramación exenta de células de soporte mediante el uso de medios químicamente definidos para la obtención de iPSCs humanas sin huellas. Estas mejoras

posibilitaron la obtención rutinaria de iPSCs humanas sin huellas a partir de fibroblastos cutáneos y probablemente muchos otros tipos de células, haciendo así la tecnología fácilmente adaptable a la producción de grado clínico de ¡PSCs humanas.

Por lo tanto, en una primera realización, se proporciona una composición que comprende una población de células iPS básicamente exentas de elementos retrovirales exógenos y un medio que comprende inhibidores de la señalización añadidos externamente. En ciertos aspectos, estas células iPS pueden estar sustancialmente exentas, o preferiblemente básicamente exentas de, elementos genéticos o de vectores exógenos. Por ejemplo, estas células iPS se pueden obtener a partir de una o más células humanas. En un aspecto adicional, las células de la población pueden comprender el genoma de un individuo humano seleccionado, tal como un paciente humano.

En ciertos aspectos, las células humanas son células humanas primarias, que son células obtenidas directamente de un sujeto humano vivo, y pueden excluir el uso de una línea de células establecidas o inmortalizadas. Ciertas realizaciones pueden incluir el uso de células humanas diferenciadas de manera terminal. Los ejemplos no limitantes de la célula humana primaria incluyen un fibroblasto, un queratinocito, una célula hematopoyética, una célula mesenquimatosa, una célula adiposa, una célula endotellal, una célula neuronal, una célula muscular, una célula mamarla, una célula hepática, una célula renal, una célula cutánea, una célula del tracto digestivo, una célula del cúmulo, una célula glandular, o una célula de islote pancreático. De manera más específica, la célula humana primarla puede ser una célula progenitora hematopoyética, tal como una célula CD34+. La célula humana primaria se puede obtener de una muestra de sangre, una muestra de pelo, una muestra de piel, o de cualquier fuente conocida para una persona de experiencia habitual en la técnica.

Los inhibidores de la señalización pueden ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), un inhibidor de la proteína quinasa quinasa activada por mitógeno (MEK), un inhibidor de receptores de factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor inhibidor de leucemia (LIF), y una combinación de los mismos. En particular, la composición comprende la población de células y una combinación de inhibidor de GSK-3, inhibidor de MEK, inhibidor de receptores de TGF-p, y opcionalmente, LIF. El medio puede comprender además inhibidor de ROCK o inhibidor de Miosina II añadidos externamente. El inhibidor de ROCK puede ser HA-1. El medio puede comprender además FGF añadido externamente. En ciertos aspectos, la composición puede comprender además un medio químicamente definido. Los ejemplos no limitantes de un medio químicamente definido incluyen el medio TeSR, medio de cultivo de células embrionarias humanas, medio N2B27 y los derivados de los mismos.

La composición puede comprender además un componente de la matriz para sustituir las células de soporte para mantener el cultivo de la población de células. El componente de la matriz para la adhesión celular puede ser cualquier material... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para producir una población de células iPS humanas capaces de diferenciarse hasta células o tejidos completamente diferenciados, en el que las células iPS están sustancialmente exentas de elementos genéticos exógenos, que comprende:

a) obtener células somáticas que comprenden un elemento genético extracromosómico que expresa uno o más factores de reprogramación;

b) cultivar las células somáticas y las células de la progenie de las mismas en una condición de reprogramación que comprende el inhibidor de GSK-3 añadido externamente y al menos uno de inhibidor de MEK, e inhibidor de receptores de TGF-p, por lo que se produce una población de células iPS; y

c) expandir la población de células iPS en una condición de expansión que tiene un medio de expansión básicamente exento de inhibidor de GSK-3, inhibidor de MEK, e inhibidor de receptores de TGF-p añadidos externamente.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la condición de reprogramación está básicamente exenta de células de soporte.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo se lleva a cabo en condiciones definidas exentas de suero y de células de soporte.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la condición de reprogramación comprende un componente de la matriz tal como Matrigel.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula somática es una célula humana, un fibroblasto, un queratinocito, una célula hematopoyética, una célula mesenquimatosa, una célula adiposa, una célula endotelial, una célula neuronal, una célula muscular, una célula mamaria, una célula hepática, una célula renal, una célula cutánea, una célula del tracto digestivo, una célula del cúmulo, una célula glandular, o una célula de islote

pancreático.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el elemento genético extracromosómico comprende ADN, ARN, o se define adicionalmente como un vector episómico que está básicamente exento de elementos bacterianos o comprende un origen de replicación y uno o más casetes de expresión para la expresión de factores de reprogramación, en el que uno o más de dichos casetes de expresión comprenden además una secuencia de nucleótidos que codifica un factor que actúa en trans que se une al origen de replicación para replicar un molde extracromosómico, y/o en el que la célula somática expresa tal factor que actúa en trans.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el origen de replicación es un origen de replicación de un herpesvirus linfotrópico y corresponde a oriP del virus de Epstein Barr (EBV), herpesvirus de sarcoma de Kaposi (KSHV), Herpesvirus saimirí (HS), o virus de la enfermedad de Marek (MDV).

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los factores de reprogramación comprenden uno o más seleccionados del grupo que consiste en Sox, Oct, Nanog, Lin-28, Klf4, c-Myc, un muíante u homólogo de myc que es deficiente de transformación, y SV4LT.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además seleccionar las células iPS basándose en una o más características de las células embrionarias.

1. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el medio de reprogramación comprende además LIF añadido externamente, inhibidor de quinasa asociada a Rho (ROCK) añadido externamente o inhibidor de miosina II, o factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) añadido externamente.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la señalización de ROCK es HA-1.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el medio de expansión, el medio de reprogramación o ambos están definidos químicamente, preferiblemente en el que el medio de expansión, el medio de reprogramación o ambos son medio TeSR, medio de cultivo de células embrionarias humanas, o medio N2B27.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el medio de reprogramación tiene FGF añadido externamente y/o en el que el medio de reprogramación está básicamente exento de TGF(3 añadido externamente.