Reactivo de lisis, unión y/o lavado que se puede usar para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos.

Reactivo de lisis, unión y/o lavado que comprende:

- al menos un compuesto caotrópico,

- al menos un compuesto de tampón seleccionado preferentemente del grupo que comprende tris(hidroximetil)aminometano, N-(tri(hidroximetil)metil)glicina, N,N-bis(2-hidroxietil)-glicina, ácido 3-(Nmorfolino) propanosulfónico, ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico), ácido piperazin-1,4-bis(2- etanosulfónico), ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico, ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico y/o tampón fosfato y

- al menos un tensioactivo no iónico basado en polioxietileno que es un éter de alcohol graso de polioxietileno seleccionado del grupo cetiléter de polioxietileno, esteariléter de polioxietileno y/u oleiléter de polioxietileno en el intervalo de ≥ 8 % en peso/volumen a ≤ 30 % en peso/volumen en relación con el volumen total del reactivo.

Reactivo de lisis, unión y/o lavado que se puede usar para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un reactivo de lisis, unión y/o lavado así como a un procedimiento para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos. El reactivo de lisis, unión y/o lavado así como el procedimiento son particularmente adecuados para fines de aplicación en el diagnóstico molecular.

Antecedentes técnicos

En el estado de la técnica es conocida una pluralidad de procedimientos para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), de células, cultivos celulares o cultivos de virus.

En este caso, los procedimientos "clásicos" para el aislamiento de ácidos nucleicos, que se llevan a cabo muchas veces manualmente, se basan en un procedimiento monoetápico en el que, después de la adición de un tampón acuoso y un agente de extracción orgánico, se lleva a cabo una extracción. Los ácidos nucleicos permanecen en la fase acuosa y pueden aislarse después de la separación de la fase orgánica que contiene sustancias acompañantes indeseadas.

Estos procedimientos usan, por un lado, habitualmente agentes de extracción orgánicos perjudiciales para la salud, tales como cloroformo o fenol, por otro lado, las impurezas solubles en agua permanecen en la fase acuosa que contiene los ácidos nucleicos que se tienen que separar en otras etapas de purificación.

Por tanto, en el estado de la técnica ha adquirido importancia un procedimiento alternativo que se basa en la adsorción selectiva de ácidos nucleicos a soportes sólidos, la mayoría de las veces minerales, tales como dióxido de silicio. El principio de unión se basa en una unión reversible de los ácidos nucleicos bajo la influencia de las denominadas sales caotrópicas y/o alcohol a la superficie de dióxido de silicio. En un procedimiento multietápico se añaden a la muestra que contiene ácido nucleico distintas soluciones o mezclas, la mayoría de las veces soluciones o mezclas de lisis, unión, lavado y/o elución y en una etapa final del procedimiento se eluye el ácido nucleico purificado del soporte añadido como tarde en la etapa de unión.

El principio básico de ambos procedimientos se basa en que en una primera etapa se lisan las células, en particular las células vegetales, animales, humanas, bacterianas o de virus. Para esto, las células en primer lugar se incuban con un tampón de lisis que disgrega las células.

En el estado de la técnica son conocidos tampones y procedimientos para la lisis de materiales celulares de una muestra biológica. Los tampones de lisis conocidos contienen con frecuencia el tensioactivo monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween® 2). Este tensioactivo se usa para, en el marco de la lisis celular, pasar las impurezas a un estado soluble o estabilizado para separar las mismas del ácido nucleico. (Véase, por ejemplo, el documento W26/23471 o DE1147439). Es desventajoso en los tampones de lisis que contienen monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween® 2) que los mismos no son estables durante el almacenamiento. De este modo, por ejemplo, disminuye el valor del pH. En particular es desventajoso que durante el uso de estos tampones de lisis después del almacenamiento disminuye el rendimiento de los ácidos nucleicos aislados. Además, es desventajoso que los eluidos que contienen ácido nucleico están enturbiados, lo que señala la presencia de impurezas que pueden alterar el uso posterior de los ácidos nucleicos aislados.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención era poner a disposición un agente que superase al menos una de las desventajas que se han mencionado anteriormente del estado de la técnica y que presentase, a este respecto, propiedades de lisis, unión y/o lavado en la medida de lo posible igual de buenas o mejores.

El objetivo se resuelve mediante un reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con la reivindicación 1 de la presente invención. Según esto se pone a disposición un reactivo de lisis, unión y/o lavado que comprende:

- al menos un compuesto caotrópico,

- al menos un compuesto de tampón seleccionado preferentemente del grupo que comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), N-(tri(hidroximetil)metil)glicina (tricina), N, N-bis(2-hidroxietil)-glicina (BICIN), ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfón¡co) (HEPES), ácido piperazin-1,4-b¡s(2-etanosulfón¡co) (PIPES), ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico (CHES), ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES), ácido 3- (N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) y/o tampón fosfato y

- al menos un tensioactivo no iónico basado en polioxietileno que es un éter de alcohol graso de polioxietileno seleccionado del grupo cetiléterde polioxietileno, esteariléter de polioxietileno y/u oleiléter de polioxietileno en el intervalo de > 8 % (peso/volumen) a < 3 % (peso/volumen) en relación con el volumen total del reactivo.

En el sentido de la presente Invención, por la expresión "reactivo de lisis, unión y/o lavado" se entiende reactivos que son reactivos de lisis, reactivos de unión o reactivos de lavado al igual que también reactivos que pueden actuar como reactivo de lisis al igual que como reactivo de unión y de lavado. En particular, en el sentido de la presente invención por la expresión "reactivo de lisis, unión y/o lavado" se entiende también mezclas de reactivos de lisis, reactivos de unión y/o reactivos de lavado de acuerdo con la invención.

En el sentido de la presente invención, por el término "reactivo" se entiende reactivo de lisis, unión y/o lavado.

En el sentido de la presente invención, por la expresión "compuesto caotrópico" se entiende compuestos que tienen un efecto desnaturalizante sobre proteínas y que en particular destruyen la estructura regular, basada en la formación de enlaces de puentes de hidrógeno, del agua líquida.

En el sentido de la presente invención, por la expresión "compuesto de tampón" se entiende compuestos que pueden poner a disposición un tamponamiento o una estabilización del valor del pH de una solución acuosa.

En el sentido de la presente invención, por la expresión "tampón fosfato" se entiende sales de fosfato tales como dihidrogenofosfatos, por ejemplo, dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4) o dihidrogenfosfato sódico (Nah^PO/i) e hidrogenofosfatos, por ejemplo, hidrogenofosfato disódico dihidrato (NahhPCXi 2 H2O) o hidrogenofosfato dipotásico. El uso de mezclas de las sales de fosfato también es posible. Otro tampón fosfato habitual es PBS (solución salina tamponada con fosfato), que contiene cloruro sódico, Na2HP4, cloruro potásico y KH2PO4.

En el sentido de la presente invención, por la expresión "ácido nucleico" se entiende en particular, pero sin limitación, ácidos nucleicos naturales, preferentemente aislados, lineales, ramificados o circulares, tales como ARN, en particular ARNm, ARNip, miARN, ARNnp, ARNt, ARNnh o ribozimas, ADN, ADN plasmídico y similares, ácidos nucleicos sintéticos o modificados, transcritos in vitro, por ejemplo, oligonucleótidos, en particular cebadores, sondas o patrones que se pueden usar para la PCR, ácidos nucleicos marcados con digoxigenina, biotina o colorantes fluorescentes, ácidos nucleicos metilados o los denominados PNA (ácidos peptidonucleicos, "peptide nucleic acids").

En el sentido de la presente invención, por el término "tensioactivo" se entiende sustancias con actividad interfacial y/o actividad superficial.

En el sentido de la presente invención, por la expresión "alcohol graso" se entiende alcoholes con una longitud de cadena con una cantidad de seis a 22 átomos de carbono, preferentemente de 8 a 2 átomos de carbono, con preferencia de 1 a 18 átomos de carbono, de forma particularmente preferente de 12 a 18 átomos de carbono. Se reivindican alcoholes con una cantidad de 16 o 18 átomos de carbono. Los alcoholes grasos ciertamente pueden estar mono- o poliinsaturados, sin embargo, preferentemente se trata de alcoholes grasos saturados.

En el sentido de la presente invención, "polioxietileno" se refiere a una unidad H-(CH2CH2)n, representando n preferentemente un número entero de 2 a 15, más preferentemente de 4 a 12, aún más preferentemente de 8 a 8 y con la mayor preferencia un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3, 31 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,

49, 5, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 7, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,

8, 81, 82, 83,... [Seguir leyendo]

1. Reactivo de lisis, unión y/o lavado que comprende:

- al menos un compuesto caotrópico,

- al menos un compuesto de tampón seleccionado preferentemente del grupo que comprende

tris(hidroxlmetil)am¡nometano, N-(tri(hidroximet¡l)metil)glicina, N, N-bis(2-hidroxietil)-gllcina, ácido 3-(N-

morfolino)propanosulfónico, ácido N-(2-h¡droxietil)piperaz¡n-N'-(2-etanosulfón¡co), ácido piperazin-1,4-bis(2- etanosulfónico), ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico, ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico y/o tampón fosfato y

- al menos un tensioactivo no iónico basado en polioxietileno que es un éter de alcohol graso de polioxietileno seleccionado del grupo cetiléter de polioxietileno, esteariléter de polioxietileno y/u oleiléter de polioxietileno en el intervalo de > 8 % en peso/volumen a á 3 % en peso/volumen en relación con el volumen total del reactivo.

2. Reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el éter de alcohol graso de polioxietileno comprende un constituyente de polioxietileno que contiene de 2 a 15 unidades de (CH2CH2O).

3. Reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que el éter de alcohol graso de polioxietileno es un cetiléter de polioxietileno.

4. Reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el reactivo de lisis, unión y/o lavado comprende tensioactivo no iónico en el intervalo de > 9 % en peso/volumen a < 3 % en peso/volumen, preferentemente en el intervalo de > 1 % en peso/volumen a < 3 % en peso/volumen, con preferencia en el intervalo de > 15 % en peso/volumen a 2 % en peso/volumen en relación con el volumen total del reactivo.

5. Reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el compuesto caotrópico es una sal de sodio o guanidinio seleccionada, preferentemente, del grupo que comprende ioduro sódico, perclorato sódico, clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio y/o una mezcla de dos o varias sales de los mismos.

6. Reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el reactivo de unión comprende un alcanol ramificado o no ramificado, preferentemente un alcohol ramificado o no ramificado con uno a cinco átomos de carbono seleccionado preferentemente del grupo que comprende metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, butanol o pentanol ramificado o no ramificado y/o mezclas de los mismos.

7. Uso de un reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos.

8. Procedimiento para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos de una muestra biológica que contiene ácidos nucleicos que comprende las siguientes etapas del procedimiento:

a) lisis de la muestra biológica,

b) inmovilización del ácido o los ácidos nucleicos liberados en una matriz a base de uno o varios compuestos de óxido de silicio en presencia de un compuesto caotrópico y/o un alcanol ramificado o no ramificado,

c) opcionalmente lavado del ácido o los ácidos nucleicos inmovilizados sobre la matriz,

d) opcionalmente separación del ácido nucleico unido,

llevándose a cabo la lisis y/o inmovilización en presencia de una composición de lisis y/o unión que comprende:

- al menos un compuesto caotrópico

- al menos un compuesto de tampón y

- al menos un tensioactivo no iónico basado en polioxietileno que es un éter de alcohol graso de polioxietileno seleccionado del grupo cetiléter de polioxietileno, esteariléter de polioxietileno y/u oleiléter de polioxietileno en el intervalo de > ,1 % en peso/volumen a < 3 % en peso/volumen en relación con el volumen total de la composición.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que el éter de alcohol graso de polioxietileno comprende un constituyente de polioxietileno que contiene de 2 a 15 unidades de (CH2CH2O).

1. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, caracterizado por que el éter de alcohol graso de polioxietileno es un cetiléter de polioxietileno.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la composición de lisis y/o unión comprende tensioactivo no iónico en el intervalo de > ,2 % en peso/volumen a < 3 % en peso/volumen, preferentemente en el intervalo de > 3 % en peso/volumen a < 1 % en peso/volumen, con

preferencia en el intervalo de > 3,2 % en peso/volumen a < 8 % en peso/volumen en relación con el volumen total de la composición.

12. Kit para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos de una muestra biológica que contiene ácidos 5 nucleicos que comprende un reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Uso de tensioactivos no iónicos basados en polioxietileno, en concreto éter de alcohol graso de polioxietileno seleccionado del grupo cetiléter de polioxietileno, esteariléter de polioxietileno y/u oleiléter de polioxietileno para la preparación de reactivos de unión, lisis y/o lavado estables en almacenamiento de acuerdo con una o varias de las

reivindicaciones 1 a 6.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, siendo el éter de alcohol graso de polioxietileno un cetiléter de polioxietileno.