Proteínas de fusion humanas recombinantes de EPO-Fc con vida media prolongada y actividad eritropoyética in vivo mejorada.

Una proteína de fusión que tiene una vida media prolongada in vivo en comparación con origen natural o recombinante humana nativa que comprende eritropoyetina:



a) una molécula de eritropoyetina humana de origen natural que tiene un residuo cisteína en la proximidad de un terminal C de los mismos; y

(b) un fragmento Fc de IgG1 humano que comprende una región de bisagra, y los dominios CH2 y CH3, en el que un terminal N de dicho fragmento Fc está directamente vinculado a dicho terminal C de dicha molécula de eritropoyetina y en donde dicho fragmento Fc tiene una sustitución de un solo aminoácido sustituyendo el residuo de cisteína localizado cercana a dicha molécula eritropoyetica con un residuo que no es cisteína, por lo que el primer residuo de cisteína de dicha región bisagra situada más cerca de dicho terminal N está separado al menos 12 aminoácidos aparte de dicho residuo de cisteína de dicha molécula de eritropoyetina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CA2007/000107.

Solicitante: Novagen Holding Corporation.

Nacionalidad solicitante: Islas Caimán.

Dirección: 2nd Floor, The Grand Pavilion Commercial Centre, 802 West Bay Road, P.O. Box 10338 George Town, Grand Cayman KY1-1003 ISLAS CAIMAN.

Inventor/es: LIU, LONGBIN, ZHANG,RUI, XU,Jing, WANG,HAITAO, DU,YONG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/18 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Factores de crecimiento; Reguladores de crecimiento.
  • A61K47/42 A61K […] › A61K 47/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos utilizados, p. ej. portadores, aditivos inertes. › Proteínas; Polipéptidos; Sus productos de degradación; Sus derivados.
  • A61K47/48 A61K 47/00 […] › estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento.
  • A61P7/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.Medicamentos para el tratamiento de trastornos de la sangre o del fluido extracelular.
  • C07K14/505 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Eritropoyetina (EPO).
  • C07K16/18 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas   solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N15/13 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Inmunoglobulinas.
  • C12N15/18 C12N 15/00 […] › Hormonas de crecimiento.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.

PDF original: ES-2539759_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Campo Técnico

[1] Esta aplicación se refiere a proteínas de fusión de la eritropoyetina humana.

Antecedentes

[2] La eritropoyetina humana (EPO por sus siglas en ingles), un miembro de la familia del factor de crecimiento hematopoyético, se sintetiza principalmente en el riñón adulto y el hígado fetal en respuesta a la hipoxia tisular debido a la disminución de la disponibilidad de oxígeno en la sangre [1]. La función principal de la EPO es actuar directamente sobre ciertos progenitores y precursores de glóbulos rojos en la médula ósea para estimular la síntesis de la hemoglobina y los glóbulos rojos maduros. También controla la proliferación, la diferenciación y maduración de los glóbulos rojos. La eritropoyetina humana recombinante tiene la misma secuencia de aminoácidos al igual que la eritropoyetina de origen natural, se ha producido y aprobado para tratar la anemia asociada con la insuficiencia funcional del riñón, cáncer y otras condiciones patológicas [2], Además de sus propiedades eritropoyéticas, informes de investigación recientes [3] indican que la EPO también actúa sobre células de la médula no ósea tales como las neuronas, lo que sugiere otras posibles funciones fisiológicas / patológicas de la EPO en el sistema nervioso central (CNS por sus siglas en ingles) y otros órganos / sistemas. Dado que los receptores de EPO se han encontrado en muchos órganos diferentes, la EPO puede tener múltiples efectos biológicos, como el de actuar como un agente anti-apoptótico.

[3] La eritropoyetina humana es una glicoproteína con un peso molecular de 3,4 kilodaltons. Los hidratos de carbono representan aproximadamente 39% de su masa total. El gen eritropoyético se encuentra en el cromosoma 7q11 -22 y se extiende por una región de 5.4kb con cinco exones y cuatro intrones [4], El precursor de la EPO consiste en 193 aminoácidos. De la escisión de la secuencia líder y el último aminoácido Arg por modificación post- traduccional se obtiene la EPO madura que teniendo esta 165 aminoácidos. La glicosilación, con tres sitios ligados a N en Asn 24, Asn38, Asn83 y un sitio O-ligado en Ser126, juega un papel crucial en la biosíntesis, estructura terciaria y la bioactividad in vivo de la EPO [5], La EPO funciona uniéndola a un receptor de la eritropoyetina, una transmembrana glicosilada y fosforilada polipéptida con el peso molecular de 72-78 kilodaltons. Esta unión provoca la homodimerización de los receptores que conducen a la activación de varias vías de transducción de señales: JAK2 / STAT5 del sistema, proteínas G, canales de calcio, y quinasas. Se necesitan dos moléculas de proteína EPO para unirse simultáneamente a una molécula de receptor para lograr una óptima activación de receptores[6].

[4] Como el primer factor de crecimiento hematopoyético aprobado para la terapia humana, la EPO humana recombinante (rHuEPO por sus siglas en ingles) se ha utilizado para el tratamiento de la anemia resultante de la insuficiencia renal crónica, cánceres (principalmente anemia asociada a la quimioterapia), enfermedades autoinmunes, SIDA, cirugía, trasplante de médula ósea y los síndromes mielodisplásicos, etc. Curiosamente, los estudios recientes han observado también que la rHuEPO tiene funciones que no pertenecen al sistema sanguíneo y muestra el potencial de ser utilizado como un fármaco neuroprotector para la isquemia cerebral, trauma cerebral, enfermedad inflamatoria y trastornos degenerativos neuronales [7].

[5] Actualmente, tres tipos de rHuEPO o rHuEPO análogos están disponibles comercialmente, principalmente a rHuEPO alfa, rHuEPO beta, y darbepoetina alfa [8], Estas tres proteínas recombinantes se unen al mismo receptor de la eritropoyetina, pero difieren en estructura, grado de glicosilación, afinidad de unión al receptor y metabolismo in vivo. Desde la introducción inicial de rHuEPO-alfa en la década de 198, los médicos reconocieron rápidamente el requisito de dosis / inyección frecuente de la droga como una deficiencia significativa. La media de la vida media in vivo de la rHuEPO alfa y beta administradas por vía intravenosa o subcutánea son sólo 8,5 y 17 horas, respectivamente [9, 1], Por lo tanto, los pacientes necesitan un horario de inyección diario, dos o tres veces por semana, lo cual impone una carga para los pacientes y profesionales de la salud. Por lo tanto, ha habido una necesidad desde hace mucho tiempo de desarrollar eritropoyetinas recombinantes análogas que tienen una media- vida in vivo mas larga y / o aumento de la actividad eritropoyética.

[6] Se han hecho intentos en la técnica anterior para cambiar genéticamente o modificar químicamente la estructura de la proteína de la eritropoyetina nativa, ya sea ralentizando su metabolismo in vivo o mejorando sus propiedades terapéuticas. Por ejemplo, parece que hay una correlación directa entre las cantidades de hidratos de carbono que contienen ácido siálico de la molécula de EPO y su metabolismo in vivo y la actividad funcional. Si se aumenta el contenido de hidratos de carbono de la molécula de EPO, por consecuencia resultara con una vida media más larga y actividades mejoradas ¡n vivo [11, 12], Amgen ha diseñado la rHuEPO darbepoetina alfa analógica que incluye 5 ligados a N cadenas de carbohidratos, dos más que la rHuEPO. La darbepoetina alfa, también conocida como la proteína novel estimulante de la eritropoyesis (NESP por sus siglas en ingles) y se vende bajo la marca comercial AranespTM. Darbepoetina alfa difiere de EPO humana nativa en cinco posiciones (Ala3Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn, Pro9Thr) que permite la unión de dos oligosacáridos adicionales ligados

a N en las posiciones de residuos asparagina 3 y 88. La darbepoetina alfa se une al receptor de la EPO en una manera idéntica que la EPO nativa para inducir la señalización intracelular que implica la fosforilación de la tirosina por JAK-2 cinasa y las mismas moléculas intracelulares Ras / MAP-k, P13-ky STAT-5. Debido al mayor contenido en carbohidratos, la vida media de la darbepoetina alfa en animales y seres humanos es casi tres veces más larga que la de la rHuEPO- alfa (25,3 horas frente a 8,5 horas) [9], La Darbepoetina alfa (AranespTM) también parece mostrar una mayor bioactividad en comparación con la EPO de origen natural o la EPO humana recombinante in vivo [13] y ha sido aprobada por la FDA como un medicamento rHuEPO de segunda generación; este fármaco sólo necesita ser administrado una vez por semana para alcanzar los efectos terapéuticos iguales que los de inyectarse 2-3 veces por semana de rHuEPO [1, 14, 15].

[7] Otros intentos para prolongar la vida media de la EPO se han centrado en aumentar el peso molecular de la proteína EPO a través de la conjugación química con polietilenglicol y similares. PEGylated- EPO tiene un peso molecular mucho más grande y está protegido de ser eliminado de la circulación y por lo tanto tiene una vida media plasmática más larga [16], Sin embargo, la PEGilación puede alterar la estructura de la proteína resultante en los cambios imprevistos de la función y la especificidad de la mitad de EPO. También hay informes del aumento del peso molecular de la EPO por otros métodos, tales como enlazar la molécula de EPO a una proteína portadora (albúmina humana), o para formar la homodimerización de dos moléculas completas de EPO mediante el uso de péptldos que unen (de 3 a 17 -aminoácidos) o por químicos reactivos de reticulación [17,18, 19, 2], Aunque todos estos métodos han logrado cierto éxito en la extensión de la vida media y la mejora de las actividades de la EPO, la combinación de la molécula de EPO con el fragmento Fe de la inmunoglobulina humana (IgG por sus siglas en ingles) en una proteína de fusión como se describe en la presente solicitud logra ventajas únicas.

[8] La inmunoglobulina IgG humana se compone de cuatro polipéptidos enlazados covalentemente por enlaces de disulfuro (dos coplas Idénticas de la cadena ligera y la cadena pesada). La proteolisis de la IgG molécula por papaína genera dos fragmentos Fab y un fragmento Fe. El fragmento Fe consta de dos polipéptidos unidos entre sí por enlaces de disulfuro. Cada polipéptido, a partir de N- a C-terminal, se compone de una región bisagra, un dominio de CH2 y un dominio de CH3. La estructura fragmento de Fe es casi la misma entre todos los subtipos de Inmunoglobulina humana. La IgG se encuentra entre una de las proteínas más abundantes en la sangre humana y constituye del 7 a 75% de las inmunoglobulinas totales en el suero humano. La vida media de la IgG en la circulación es la más larga entre todos los cinco tipos de inmunoglobulinas y puede llegar a 21 días.

[9] La tecnología de bio-ingeniería modem se ha aplicado con éxito a la creación de proteínas de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína de fusión que tiene una vida media prolongada in vivo en comparación con origen natural o recombinante humana nativa que comprende eritropoyetina:

a) una molécula de eritropoyetina humana de origen natural que tiene un residuo cisteína en la proximidad de un terminal C de los mismos; y

(b) un fragmento Fe de lgG1 humano que comprende una región de bisagra, y los dominios CH2 y CH3, en el que un terminal N de dicho fragmento Fe está directamente vinculado a dicho terminal C de dicha molécula de eritropoyetina y en donde dicho fragmento Fe tiene una sustitución de un solo aminoácido sustituyendo el residuo de cisteína localizado cercana a dicha molécula eritropoyetica con un residuo que no es cisteína, por lo que el primer residuo de cisteína de dicha región bisagra situada más cerca de dicho terminal N está separado al menos 12 aminoácidos aparte de dicho residuo de cisteína de dicha molécula de eritropoyetina.

2. La proteína tal como se define en la reivindicación 1, en el que la vida media de dicha proteína es al menos tres veces mayor que dicha eritropoyetina humana nativa.

3. La proteína se define en la reivindicación 2 que ha mejorado la bioactividad eritropoyética en comparación a dicho eritropoyetina humana nativa.

4. La proteína de fusión como se define en la reivindicación 1, en el que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos presente en la SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 28 a 426 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1B).

5. Un constructo de proteína dimérica que comprende dos proteínas de fusión como se define en la reivindicación 1.

6. Una composición farmacéutica que comprende una proteína como se define en la reivindicación 1 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable

portador, adyuvante o diluyente.

7. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 7 que comprende la secuencia definida en la SEQ ID NO: 1 (nucleótidos 82 a 132 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1B).

9. Una línea de células transfectadas con una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 8.

1. Un método para producir una proteína como se define en la reivindicación 1, que comprende cultivar una línea celular transfectada con la nucleico

secuencia de ácido definido en la reivindicación 8 y purificar el polipéptido codificado por el mismo.

11. La proteína tal como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o la composición farmacéutica como se define en la reivindicación 6 para la estimulación de la eritropoyesis en un mamífero.

12. La proteína de fusión como se define en la reivindicación 1, en el que dicho residuo no-cisteína es un aminoácido

neutro.

13. La proteína de fusión como se define en la reivindicación 12, en el que el aminoácido neutro es la glicina.

14. Un dímero que comprende proteínas primera y segunda de fusión cada uno como se define en las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha región de bisagra de dicha proteína de fusión se une primero a dicha región de bisagra de dicha segunda proteína de fusión por enlaces disulfuro.


 

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