Producción de carotenoides en levadura y hongos oleaginosos.

Un hongo Yarrowia recombinante, caracterizado por que:

a) el hongo es oleaginoso por que puede acumular lípidos hasta al menos 20 % de su peso celular seco;

y

b) el hongo produce al menos un carotenoide, y puede acumular el carotenoide producido hasta al menos 1 % de su peso celular seco; en el que el hongo comprende una modificación carotenogénica,

la modificación confiere al hongo la capacidad de producir el al menos un carotenoide hasta un nivel de al menos 1 % de su peso celular seco,

la modificación carotenogénica aumenta la expresión o actividad de los siguientes polipéptidos carotenogénicos:

polipéptido de GGPP sintasa, polipéptido de fitoeno sintasa, polipéptido de fitoeno deshidrogenasa, polipéptido de licopeno ciclasa, y polipéptido de HMG CoA reductasa,

en el que los polipéptidos carotenogénicos derivan de un grupo de microorganismos que consiste en: Y. lipolytica, M. circinelloides, S. cerevisiae, N. crassa, N. aromaticivorans, P. marcusii.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11167788.

Solicitante: DSM IP ASSETS B.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: HET OVERLOON 1 6411 TE HEERLEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: TRUEHEART, JOSHUA, BAILEY,RICHARD, MADDEN,KEVIN T.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A23L1/275 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A23 ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES.A23L ALIMENTOS, PRODUCTOS ALIMENTICIOS O BEBIDAS NO ALCOHOLICAS NO CUBIERTOS POR LAS SUBCLASES A21D O A23B - A23J; SU PREPARACION O TRATAMIENTO, p. ej. COCCION, MODIFICACION DE LAS CUALIDADES NUTRICIONALES, TRATAMIENTO FISICO (conformación o tratamiento, no enteramente cubierto por la presente subclase, A23P ); CONSERVACION DE ALIMENTOS O DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS, EN GENERAL (conservación de la harina o las masas panificables A21D). › A23L 1/00 Alimentos o productos alimenticios; Su preparación o tratamiento (su conservación en general A23L 3/00). › Adición de colorantes o de pigmentos con o sin auxiliares ópticos.
  • C12N15/80 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para hongos.
  • C12P23/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de compuestos que contienen un ciclo ciclohexeno con una cadena lateral insaturada de al menos diez átomos de carbono unidos por enlaces dobles conjugados, p. ej. carotenos (que contienen heterociclos C12P 17/00).
  • C12R1/645 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Hongos.

PDF original: ES-2546484_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Producción de carotenoides en levadura y hongos oleaginosos Antecedentes de la invención Los carotenoides son pigmentos orgánicos que varían en su color de amarillo a rojo que se producen de forma natural por ciertos organismos, incluyendo organismos fotosintéticos (por ejemplo plantas, algas, cianobacterias) , y algunos hongos. Los carotenoides son responsables del color naranja de las zanahorias, así como del rosa en los flamencos y el salmón, y del rojo en las langostas y camarones. Los animales, sin embargo, no pueden producir carotenoides y deben recibirlos a través de su dieta.

Los pigmentos de carotenoides (por ejemplo, β-caroteno y astaxantina) se usan de forma industrial como ingredientes para alimentos y piensos, tanto cumpliendo una función nutricional como potenciando la aceptación del consumidor. Por ejemplo, la astaxantina se usa ampliamente en acuicultura de salmón para proporcionar la coloración naranja característica de sus homólogos silvestres. Algunos carotenoides también son precursores de vitamina A. Además, los carotenoides tienen propiedades antioxidantes, y pueden tener diversos beneficios para la salud (véase, por ejemplo, Jyonouchi et al., Nutr. Cancer 16: 93, 1991; Giovannucci et al., J. Nati. Cancer Inst. 87: 1767, 1995; Miki, Pure Appl Chem 63: 141, 1991; Chew et al., Anticancer Res. 19: 1849, 1999; Wang et al., Antimicrob. Agents Chemother. 44: 2452, 2000) . Algunos carotenoides tales como β caroteno, licopeno y luteína se venden actualmente como complementos nutricionales.

En general, los sistemas biológicos que producen carotenoides son inabordables industrialmente y/o producen los compuestos a niveles tan bajos que el aislamiento a escala comercial no es practicable. Por lo tanto, la mayoría de los carotenoides usados en la industria se producen por síntesis química. Existe la necesidad de sistemas biológicos mejorados que producen carotenoides. Se han realizado algunos intentos previamente para modificar por ingeniería genética ciertas bacterias u hongos para producir niveles mayores de carotenoides (véase, por ejemplo, Misawa et al., J. Biotechnol. 59 :169, 1998; Visser et al., FEMS Yeast Research 4: 221, 2003; Creda-Olmed et al., Progress in Lipid Research, Vol. 33, Nº 1-2, pp. 185-192, 1994; Bhosale et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 55, Nº 4, pp. 423-427, 2001; Schmidt-Dannert C, Current Opinión in Biotechnology, Vol. 11, Nº 3, pp. 255-261, 2000; Lee et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 60, Nº 1-2, pp.1-11, 2002) . Sin embargo, son necesarios sistemas mejorados, que permitan mayores niveles de producción y mayor facilidad de aislamiento.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un sistema mejorado para la producción biológica de carotenoides. El sistema se define por un hongo Yarrowia recombinante, caracterizado por que: a) el hongo es oleaginoso por que puede acumular lípidos hasta al menos el 20 % de su peso celular seco; y b) el hongo produce al menos un carotenoide, y puede acumular el carotenoide producido hasta al menos 1 % de su peso celular seco; en el que el hongo comprende una modificación carotenogénica, la modificación confiere al hongo la capacidad para producir el al menos un carotenoide a un nivel de al menos 1 % de su peso celular seco, la modificación carotenogénica aumenta la expresión o actividad de los siguientes polipéptidos carotenogénicos: polipéptido de GGPP sintasa, polipéptido de fitoeno sintasa, polipéptido de fitoeno deshidrogenasa, polipéptido de licopeno ciclasa, y polipéptido de HMG CoA reductasa y en el que los polipéptidos carotenogénicos derivan de un grupo de microorganismos que consiste en: Y. lipolytica, M. circinelloides, S. cerevisae, N. crassa, N. aromaticivorans, P. marcusii.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1A-1D representa ciertos carotenoides comunes.

La Figura 2 representa cómo pueden acumularse niveles suficientes de acetil-CoA y NADPH en el citosol de organismos oleaginosos para permitir la producción de niveles significativos de lípidos citosólicos. Enzimas: 1, piruvato descarboxilasa; 2, malato deshidrogenasa; 3, enzima málica; 4, piruvato deshidrogenasa, 5, citrato sintasa; 6, ATP-citrato liasa; 7, citrato/malato translocasa.

Las Figuras 3A y 3B representan la ruta de biosíntesis de isoprenoide de mevalonato, que actúa típicamente en eucariotas, incluyendo hongos.

La Figura 4 representa la ruta de biosíntesis de isoprenoide independiente de mevalonato, también conocida como la ruta DXP, que típicamente actúa en bacterias y en los plástidos de plantas.

La Figura 5 representa intermedios en la ruta de biosíntesis de isoprenoides y cómo alimentan rutas biosintéticas de otras biomoléculas, incluyendo carotenoides así como compuestos no carotenoides tales como esteroles, esteroides y vitaminas, tales como vitamina E o vitamina K.

Las Figuras 6A-6D ilustran diversas rutas biosintéticas de carotenoides. La Figura 6A destaca ramas que conducen a diversas xantofilas cíclicas y acíclicas; La Figura 6B muestra ciertas rutas de X. dendrorhous que generan carotenoides dicíclicos y monocíclicos, incluyendo astaxantina; la Figura 6C muestra rutas interconectadas para convertir β-caroteno en cualquiera de una diversidad de otros carotenoides, incluyendo astaxantina; la Figura 6D representa posibles vías de síntesis de carotenoides cíclicos y xantofilas vegetales y de algas habituales de neurosporeno.

Las Figuras 7A-7C muestran un alineamiento de ciertos polipéptidos de HMG-CoA reductasa fúngicos representativos. Como puede verse, estos polipéptidos muestran una identidad muy alta en toda la región catalítica, y también tienen dominios transmembrana complejos. En algunas realizaciones de la invención, estos dominios transmembrana se alteran o se retiran, de modo que, por ejemplo, puede producirse una versión hiperactiva del polipéptido.

Las Figuras 8A-8D representan representaciones esquemáticas de plásmidos generados y descritos en detalle en la ejemplificación.

Definiciones Modificación carotenogénica: la expresión “modificación carotenogénica”, como se usa en el presente documento, se refiere a una modificación de un organismo hospedador que ajusta la producción de uno o más carotenoides, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una modificación carotenogénica puede aumentar el nivel de producción de uno o más carotenoides y/o puede alterar los niveles de producción relativos de diferentes carotenoides. En principio, una modificación carotenogénica de la invención puede ser cualquier modificación química, fisiológica, genética u otra modificación que altere de forma apropiada la producción de uno o más carotenoides en un organismo hospedador producido por ese organismo en comparación con el nivel producido en un organismo de otro modo idéntico no sujeto a la misma modificación. En la mayoría de las realizaciones, sin embargo, la modificación carotenogénica comprenderá una modificación genética, que da como resultado típicamente una producción aumentada de uno o más carotenoides seleccionados. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es uno o más de astaxantina, β-caroteno, cantaxatina, luteína, licopeno, fitoeno, zeaxantina y/o modificaciones de zeaxantina o astaxantina (por ejemplo, glucósido, zeaxantina esterificada o astaxantina) . En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es una o más xantofilas y/o una modificación de las mismas (por ejemplo, glucósido, xantofilas esterificadas) . En ciertas realizaciones, la xantofila seleccionada se selecciona del grupo que consiste en astaxantina, luteína, zeaxantina, licopeno y modificaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es uno o más de astaxantina, β-caroteno, cantaxantina, luteína, licopeno y zeaxantina y/o modificaciones de zeaxantina o astaxantina. En algunas realizaciones, el carotenoide es βcaroteno. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es astaxantina. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es distinto de β-caroteno.

Polipéptido carotenogénico: la expresión “polipéptido carotenogénico”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier polipéptido que esté implicado en el proceso de producir carotenoides en una célula, y puede incluir polipéptidos que están implicados en procesos distintos de la producción de carotenoides pero cuyas actividades afectan al alcance o nivel de la producción de uno o más carotenoides, por ejemplo eliminando un sustrato o reactivo utilizado por un polipéptido carotenoide que está implicado directamente en la producción de carotenoides. Los polipéptidos carotenogénicos incluyen... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un hongo Yarrowia recombinante, caracterizado por que:

a) el hongo es oleaginoso por que puede acumular lípidos hasta al menos 20 % de su peso celular seco; y b) el hongo produce al menos un carotenoide, y puede acumular el carotenoide producido hasta al menos 1 % de su peso celular seco; en el que el hongo comprende una modificación carotenogénica, la modificación confiere al hongo la capacidad de producir el al menos un carotenoide hasta un nivel de al menos 1 % de su peso celular seco, la modificación carotenogénica aumenta la expresión o actividad de los siguientes polipéptidos carotenogénicos: polipéptido de GGPP sintasa, polipéptido de fitoeno sintasa, polipéptido de fitoeno deshidrogenasa, polipéptido de licopeno ciclasa, y polipéptido de HMG CoA reductasa,

en el que los polipéptidos carotenogénicos derivan de un grupo de microorganismos que consiste en: Y. lipolytica, M. circinelloides, S. cerevisiae, N. crassa, N. aromaticivorans, P. marcusii.

2. El hongo de la reivindicación 1, en el que la al menos una modificación carotenogénica confiere al hongo la capacidad de producir el al menos un carotenoide hasta un nivel seleccionado del grupo que consiste en al menos 2 20 %, al menos 3 %, al menos 5 % y al menos 10 % del peso celular seco del hongo.

3. El hongo de la reivindicación 1 o 2, en el que el al menos un carotenoide se selecciona del grupo que consiste en astaxantina, β-caroteno, cantaxantina, zeaxantina, luteína, licopeno y combinaciones de los mismos.

4. El hongo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 3 caracterizado por que el hongo acumula lípidos en forma de cuerpos citoplasmáticos.

5. El hongo de la reivindicación 4, en el que el al menos un carotenoide se acumula en los cuerpos oleosos citoplasmáticos. 30


 

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