Procedimientos de producción mejorada de proteínas morfogenéticas del hueso.

Un procedimiento de producción de BMP-2 que comprende las etapas de:

i) cultivar una célula huésped adecuada que comprende una molécula de ADN que codifica una BMP-2 en un medio de cultivo que comprende hierro a una concentración de al menos 2,25 μM, un compuesto polianiónico, y si está presente piridoxal,

representa menos del 55 % de la concentración molar de vitamina B6 en el medio de cultivo; y

ii) recuperar la proteína de interés,

en el que la célula huésped se cultiva en un biorreactor que tiene una capacidad de al menos 160 l, en el que el medio de cultivo comprende además cobre a una concentración de al menos 10 nM; y

en el que la célula huésped adecuada es una célula CHO.

Procedimientos de producción mejorada de proteínas morfogenéticas del hueso.

La presente invención se refiere al campo de producción de proteínas recombinantes. En particular, la invención se refiere a procedimientos para producir factores de crecimiento peptídicos, incluyendo proteínas morfogenéticas del hueso (BMP) . 5

Los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-) poseen propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas fisiológicamente importantes (Kingsley y col., Genes Dev. 8: 133-146 (1994) ; Hoodless y col., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235-272 (1998) ) . Las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP) son miembros de la superfamilia de TGF- de factores de crecimiento y diferenciación (Rosen y col., Principles of Bone Biology 2: 919-928 (2002) ) . Algunas de las primeras pruebas de la existencia de la BMP fue la 10 capacidad del hueso desmineralizado para inducir nuevo hueso cuando se implanta en el músculo (Urist y col., Science 150: 893-99 (1965) ) . Las BMP se purificaron de forma bioquímica posteriormente a partir de hueso desmineralizado (Wang y col., PNAS 85: 9484-9488 (1988) ) y se clonaron por hibridación de oligonucleótidos radiomarcados diseñados a partir de fragmentos peptídicos de las proteínas purificadas (Wozney y col., Science 242: 1528-1534 (1988) ) . Las BMP clonadas se han expresado de forma recombinante y conservan su función. Las 15 BMP se producen típicamente de forma recombinante, debido a la dificultad, falta de pureza y bajo rendimiento, asociados con la purificación bioquímica de fuentes naturales tales como, por ejemplo, hueso.

Se sabe que BMP-2 y las proteínas relacionadas BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (también conocida como OP-1) , BMP-8 (también conocida como OP-2) , BMP-9 y BMP-10 median en el crecimiento y reparación del tejido óseo y cartilaginoso. BMP-2 se usa clínicamente en la actualidad para tratar fracturas abiertas y sin unión, fusiones 20 espinales (como parte del dispositivo médico INFUSE) , y para indicaciones ortodónticas. La disponibilidad y coste de este importante producto terapéutico dependen, en parte, del título de los cultivos celulares de mamífero usados en su producción. Sin embargo, las condiciones de cultivo que producen títulos celulares adecuados en una "escala de laboratorio" no pueden aumentarse de escala a la gran escala de fabricación necesaria para cumplir la demanda creciente de estas proteínas. En consecuencia, existe la necesidad de procedimientos de producción de proteínas 25 recombinantes, tales como BMP-2, aumentando los títulos celulares durante la producción y en los que los procedimientos sean adecuados para su uso en una escala de fabricación.

La presente invención proporciona procedimientos para producir proteínas recombinantes en una escala de fabricación sosteniendo altos títulos de células huésped, dando como resultado un aumento del rendimiento proteico. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que un medio de cultivo definido complementado 30 con metales traza sostiene títulos celulares de recogida mayores de células CHO cultivadas en un sistema de biorreactor por un proceso de realimentación por lotes a una escala de fabricación. Sin el complemento de los metales, el mismo medio sostiene el crecimiento en un biorreactor pequeño (a escala de laboratorio) pero no consiguió "aumentar de escala" a un biorreactor de escala de fabricación. La uniformidad de título se mejoró adicionalmente cuando el piridoxal en el medio se reemplazó con piridoxina. 35

Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de expresión de proteínas recombinantes que comprenden las etapas de cultivar una célula huésped adecuada que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de interés en un medio de cultivo definido en el que está presente hierro a una concentración de al menos aproximadamente 2, 25 M y si está presente piridoxal, compone menos de aproximadamente el 55 % de la concentración molar de la vitamina B6 en el medio y recuperar la proteína de interés. En algunas realizaciones, el 40 hierro está presente a una concentración de al menos aproximadamente 5 M. El medio puede comprender además cobre a una concentración de al menos aproximadamente 10 nM y cinc a una concentración de al menos aproximadamente 2 M. En algunas realizaciones, si está presente piridoxal en el medio, este está presente a una concentración de menos de aproximadamente 15 M. En realizaciones particulares, si está presente piridoxal, este está presente a una concentración de menos de aproximadamente 15 M y compone menos de aproximadamente el 45 55 % de la concentración molar de vitamina B6 en el medio. En algunas realizaciones, si está presente piridoxal en el medio, este está presente a una concentración de menos de aproximadamente 15 M o compone menos de aproximadamente el 55 % de la concentración molar de vitamina B6 en el medio.

En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO. En ciertas realizaciones, la proteína de interés es un miembro de la superfamilia de TGF-, por ejemplo, una BMP, por ejemplo, 50 una BMP-2.

En ciertas realizaciones, el medio contiene vitamina B6 a una concentración total de al menos aproximadamente 15 M. En algunas realizaciones, piridoxal, si está presente en el medio de cultivo, compone no más de aproximadamente el 55 % de la concentración molar total de vitamina B6 en el medio. En realizaciones más particulares, la vitamina B6 tiene una relación de piridoxal y piridoxina de menos de aproximadamente 1, 2. En 55 realizaciones aún más particulares, el medio no contiene piridoxal.

En una realización particular, la invención proporciona un procedimiento de producción de BMP-2 que incluye las etapas de cultivar una célula huésped adecuada que comprende una molécula de ADN que codifica una proteína BMP-2 en un medio de cultivo que comprende hierro a una concentración de al menos aproximadamente 2, 5 M y vitamina B6 a una concentración de al menos aproximadamente 15 M, y en el que si está presente piridoxal, este compone menos de aproximadamente el 55 % de la concentración molar de vitamina B6 en el medio y después recuperar una proteína BMP-2.

En algunas realizaciones, el medio también puede contener aminoácidos a una concentración total de al menos 5 aproximadamente 20 mM. El medio puede contener L-cistina a una concentración de al menos aproximadamente 0, 5 mM. En realizaciones particulares, el medio también contiene ácido L-glutámico a una concentración de no más de aproximadamente 0, 3 mM.

En ciertas realizaciones, el medio también puede contener un compuesto polianiónico, por ejemplo, dextrán sulfato, a una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/l. En algunas realizaciones, el medio puede tener una 10 osmolaridad inicial de entre aproximadamente 260 y 380 mOsm.

En ciertas realizaciones, los procedimientos de la invención son adecuados para cultivar células que han crecido en un proceso de realimentación por lotes. En realizaciones particulares, las células se cultivan en un biorreactor de tanque agitado con una capacidad de al menos aproximadamente 3 l. En realizaciones aún más particulares, la temperatura de cultivo se mantiene esencialmente constante. En algunas realizaciones, los procedimientos de la 15 invención usan medios de cultivo que sostienen una densidad celular de recogida de al menos aproximadamente 4, 0x106 células/ml.

En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un proceso o procedimiento para la producción de BMP-2, que incluye las etapas de cultivar una célula CHO que contiene una molécula de ADN que codifica una proteína BMP-2 en un medio de cultivo que comprende hierro a una concentración de al menos aproximadamente 2, 5 M, 20 aminoácidos a una concentración total de al menos aproximadamente 20 mM, L-cistina a una concentración de al menos 0, 5 mM, dextrán sulfato a una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/l y vitamina B6 a una concentración de al menos aproximadamente 15 M y en el que si está presente piridoxal, este compone menos de aproximadamente el 55 % de la concentración molar de vitamina B6 en el medio; y después recuperar una proteína BMP-2. En realizaciones particulares, el medio puede comprender además cobre a una concentración de al menos 25 aproximadamente 10 nM. En realizaciones aún más particulares, el medio puede comprender además cinc a una concentración de al menos aproximadamente 0, 2 M.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para producir BMP-2 que incluye la etapa de cultivar una célula huésped adecuada que comprende una molécula de ADN que codifica... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de BMP-2 que comprende las etapas de:

i) cultivar una célula huésped adecuada que comprende una molécula de ADN que codifica una BMP-2 en un medio de cultivo que comprende hierro a una concentración de al menos 2, 25 M, un compuesto polianiónico, y si está presente piridoxal, representa menos del 55 % de la concentración molar de vitamina B6 en el medio de 5 cultivo; y ii) recuperar la proteína de interés, en el que la célula huésped se cultiva en un biorreactor que tiene una capacidad de al menos 160 l, en el que el medio de cultivo comprende además cobre a una concentración de al menos 10 nM; y

en el que la célula huésped adecuada es una célula CHO. 10

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el hierro está en una concentración de al menos 5 M.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el medio de cultivo comprende además al menos una vitamina B6 seleccionada del grupo que consiste en piridoxina, piridoxamina, piridoxin.

5. fosfato, piridoxamin.

5. fosfato.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el medio de cultivo tiene una concentración de vitamina B6 total 15 de al menos 15 M.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el medio de cultivo tiene una relación de piridoxal con respecto a piridoxina de menos de 1, 2.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medio de cultivo comprende además cinc en una concentración de al menos 0, 2 M. 20

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto polianiónico es dextrán sulfato.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el dextrán sulfato está presente a una concentración de al menos 10 mg/l.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el dextrán sulfato tiene un peso molecular de entre 5.000 y 25 500.000 g/mol.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el medio de cultivo comprende además aminoácidos a una concentración total de al menos 20 mM.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el medio de cultivo comprende L-cistina a una concentración de al menos 0, 5 mM. 30

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el medio de cultivo comprende L-ácido glutámico a una concentración de cómo máximo 0, 3 mM.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el medio de cultivo tiene una osmolaridad inicial de entre 260 y 360 mOsm.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la BMP-2 es BMP-2 humana 35 recombinante (rhBMP-2) .

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la célula huésped se cultiva por realimentación por lotes.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la célula huésped se cultiva a una temperatura d.

3. 38 ºC. 40

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende además la etapa de purificar la BMP-2 en una resina de butil sepharose.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la purificación comprende además las etapas de aplicar un medio de cultivo acondicionado que contiene la BMP-2 a una resina de tipo heparina, obtener un eluato que contiene la BMP-2, y aplicar el eluato a la resina de butil sepharose. 45

19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

i) cultivar una célula CHO que comprende una molécula de ADN que codifica una proteína BMP-2 en un proceso de realimentación por lotes en medio de cultivo que comprende hierro a una concentración de al menos 2, 5 M, cobre a una concentración de al menos 10 nM, aminoácidos a una concentración total de al menos 20 mM, L-cistina a una concentración de al menos 0, 5 mM, dextrán sulfato a una concentración de al menos 10 mg/l y vitamina B6 a una concentración de al menos 15 M, y si está presente piridoxal, representa menos del 55 % de la concentración molar de vitamina B6 en el medio de cultivo; y ii) recuperar una proteína BMP-2, 5

en el que la célula huésped se cultiva en un biorreactor que tiene una capacidad de al menos 160 l.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el medio de cultivo comprende menos de 5 M de piridoxal.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el medio de cultivo comprende menos de 1 M de piridoxal. 10

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el medio de cultivo no comprende piridoxal.