Péptidos antimicrobianos novedosos.

Un péptido de estructura lineal, no cíclica que consiste en o comprende de 17 a 23 aminoácidos,

en donde los aminoácidos en posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son como sigue (1) G, S o falta; (2) C o falta; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K o L o falta; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o falta; (22) F o G o falta (23) G o falta.

Péptidos antimicrobianos novedosos

La presente invención se refiere a un péptido de estructura lineal, no cíclica que consiste en o comprende de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son como sigue: (1) G, S o falta; (2) C o falta; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, Wo F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, Wo L; (9) K o R; (1) Ko Lo falta; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) Ko R; (15)GoQ; (16) K o R; (17) F, Lo W; (18) F o W; (19) F, L o W; (2) W o F; (21) C o falta; (22) F o G o falta (23) G o falta. Además, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención, un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, una célula huésped que se puede hacer crecer en cultivo celular que comprende el vector de la invención, y un método de producir el péptido de la invención que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recoger el péptido producido. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el péptido de la invención, el péptido producido por el método de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención, el vector de expresión de la invención o la célula huésped de la invención y un kit que comprende el péptido de la invención, el péptido producido por el método de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención, el vector de expresión de la invención o la célula huésped de la invención.

Solo en Alemania mueren más de 6 personas por año de intoxicación bacteriana de la sangre (sepsis). Un nuevo enfoque para combatir esta y otras afecciones ha sido el uso de péptidos antimicrobianos sintéticos (PAM) en base a motivos particulares de proteínas humanas y otras, que se unen a factores de patogenicidad bacterianos tales como Mpopolisacárido (LPS). Se sabe que las últimas moléculas son, en un grado considerable, responsables de la inflamación e infección.

El enfoque para usar PAM ha ganado algunos intereses en los últimos años. Habitualmente, los PAM se basan en proteínas de defensa de unión a LPS tal como lactoferrina, granulisinas y péptidos antimicrobianos catiónicos (PAC) (Andersson et al., 1996, Garidel et al., 27, Ramamoorthy et al., 26, Vallespi et al., 23). La mayoría de estos estudios, sin embargo, se concentraron en destruir las bacterias infecciosas más que en neutralizar el LPS libre. La existencia de LPS aislado, liberado de las bacterias por la acción del sistema inmunitario o simplemente por división celular, es uno de los principales problemas en la lucha antiséptica.

Algunos estudios han usado el dominio de unión a LPS de la proteína LALF (Hoess et al., 1993, Paus et al., 22), y han sintetizado péptidos lineales y cíclicos, con los que fue posible obtener una cierta neutralización de LPS in vitro, pero también in vivo, por ejemplo, en un modelo de ratón de endotoxicidad (Dankesreiter et al., 2, Garidel et al., 27, Hoess et al., 1993, Leslie et al., 26, Mora et al., 26, Ried et al., 1996, Vallespi et al., 23). Además, el documento EP95141 describe la actividad antivírica del péptido derivado de LALF CHYRIKPTFRRLKWKYKGKFWC. Se encontró que algunos de estos péptidos tienen una semivida en suero suficiente. Sin embargo, la cuestión de si estos compuestos suprimen la endotoxicidad eficazmente y son adecuados como posibles agentes antisépticos permanece sin respuesta.

Se realizaron estudios biofísicos exhaustivos, en los que los se pudieran caracterizar parámetros esenciales importantes para la neutralización de LPS por PAM o péptidos cíclicos particulares basados en NK-lisina porcina o granulisina humana (Andrá et al., 24, Andrá et al., 27, Andrá et al., 24, Andrá et al., 24, Andrá et al., 27, Chen et al., 27). Entre estos parámetros están el potencial de superficie del grupo de cabeza de LPS, la fluidez de las cadenas acilo de lípido A, la estructura de agregado de Ifpido A, y la incorporación en liposomas de fosfolípido en ausencia y presencia de la proteína de unión a LPS LBP.

Se encontró que la neutralización de LPS por estos PAM no era lo suficientemente alta para usarlos en experimentos con animales. El problema para obtener compuestos PAM adecuados es un problema grave debido al número extremadamente alto de combinaciones posibles empezando de los 2 aminoácidos proteinogénicos. Un enfoque para desarrollar PAM adecuados debe incluir su capacidad de actuar antimicrobianamente así como de neutralizar LPS. Para esto, es necesario un conocimiento detallado del tamaño, conformación, y estructura de agregado de LPS/lípido A. Algunos de estos parámetros se han determinado en artículos previos (Brandenburg, 1993, Brandenburg et al., 1999, Brandenburg et al., 199, Brandenburg et al., 1992, Brandenburg et al., 1997, Brandenburg et al., 2, Brandenburg et al., 22, Brandenburg et al., 1993, Brandenburg et al., 1998, Brandenburg et al., 1996), para una revisión, véase Brandenburg y Wiese, 24.

Sin embargo, incluso con esta información disponible, todavía hay una necesidad de proporcionar péptidos con excelentes propiedades antimicrobianas.

Según esto la presente invención se refiere a un péptido de estructura lineal, no cíclica que consiste en o comprende de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son como sigue: (1) G, S o falta; (2) C o falta; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (1) Ko Lo falta; (11) W, Lo F; (12) Ko R; (13) F, Y o C; (14) Ko R; (15) Go Q; (16) Ko R; (17) F, Lo W; (18) F o W; (19) F, L o W; (2) W o F; (21) C o falta; (22) F o G o falta (23) G o falta.

El término "péptido" generalmente describe cadenas moleculares lineales de aminoácidos que contienen hasta 3 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptidicos. Sin embargo, como se ha definido anteriormente, el péptido de la invención consiste en o comprende de 17 a 23 aminoácidos. El número total de aminoácidos comprendidos en el péptido puede aumentar preferiblemente hasta 3 si se añaden uno o más aminoácidos a péptidos de 17 a 23 aminoácidos en sus extremos N y/o C. Dichos aminoácidos pueden o no contribuir a la funcionalidad del péptido. En otras palabras, el/los aminoácido(s) añadido(s) puede(n) o no conferir una función distinta al péptido, sea su actividad antimicrobiana o antivirica u otra función.

El número de aminoácidos puede aumentar además si el péptido de la invención se fusiona a otro péptido o a un polipéptido (véase posteriormente). Los péptidos pueden formar oligómeros que consisten en al menos dos moléculas ¡guales o diferentes. Las correspondientes estructuras de orden superior de tales multímeros se denominan, correspondientemente, homo- o heterodimeros, homo- o heterotrímeros, etc.

Las abreviaturas del código de una letra como se usan para identificar los aminoácidos a lo largo de la presente Invención se corresponden con las comúnmente usadas para aminoácidos.

El péptido de la presente invención se puede producir sintéticamente. La síntesis química de péptidos se conoce bien en la técnica. La síntesis en fase sólida se usa comúnmente y están disponibles varios sintetizadores comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados por Applied Biosystems Inc., Foster City, CA; Beckman; MultiSyntech, Bochum, Alemania, etc. También se pueden usar métodos sintéticos en fase solución aunque son menos convenientes. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la síntesis de péptidos usando Na-9- fluorenilmetoxicarbonil aminoácidos y una resina de tritilo precargada o una resina de poliestireno aminometilada con un enlazador p-carboxitritilalcohol. Los acoplamientos se pueden realizar en dimetilformamida usando N- hidroxibenzotrlazol y hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio. Los grupos protectores de cadena lateral comúnmente usados son tert-butilo para D, E e Y; tritilo para N, Q, S y T; 2,2,4,6,7- pentametildihldroxibenzofuran-5-sulfonilo para R; y butoxicarbonilo para K. Después de la síntesis, los péptidos se desprotegen y cortan del soporte polimérico por tratamiento con, por ejemplo, ácido trifluoroacético al 92%/trietilsilano al 4%/H2 al 4%. Los péptidos se pueden precipitar mediante la adición éter de tert-butílico/pentano (8:2) y purificar por HPLC de fase reversa. Los péptidos se analizan comúnmente por espectrometría de masa de desorción láser asociada a matriz tiempo de vuelo. Usando estas técnicas estándar, los aminoácidos naturales se pueden sustituir con aminoácidos no naturales, particularmente D-estereoisómeros, y también con aminoácidos con cadenas laterales que tienen diferentes longitudes o... [Seguir leyendo]

Un péptido de estructura lineal, no cíclica que consiste en o comprende de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son como sigue (1) G, S o falta; (2) C o falta; (3) Ko R; (4) Ko R; (5) Y, Wo F; (6) K o R; (7) Ko R; (8) F, Wo L; (9) Ko R; (1) K o L o falta; (11) W, Lo F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (2) W o F; (21) C o falta; (22) F o G o falta (23) G o falta.

El péptido de la reivindicación 1 que tiene cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos

1Pep17-1: KKFRRLKWKYKGKFWFW

1Pep17-2: KKYRRFRWKFKGKFWFW

1Pep17-3: RRYKKFKWRYRGRFWFW

1Pep19-1: GCKKFRRLKWKYKGKFWFWCG

1Pep19-2: GCKKYRRFRWKFKGKFWFWCG

1Pep19-3: GCRRYKKFKWRYRGRFWFWCG

1Pep19-4: GKKYRRFRWKFKGKWFWFG

1Pep19-5: GKKYRRFRWKFRGRFWFWG

1Pep19-6: GCKKFRRFKLKCKQKLWLWCG

1Pep19-7: GKKYRRFWKFKGKWFFWG

1Pep19-8: GRRYKKFRWKFKGRWFWFG

1pep19-9: GCRRFKKFRWKYKGKFWFWCG

1Pep19-1: GRRYKKFKWRFRGRFWFWG

1 Pep19-11: GCRRWKKFRWRYRGKFWFWCG

1 Pep19-12: GCRRFKKFKKWRYRGRFWFWCFG.

El péptido de la reivindicación 1 o 2 fusionado a un péptido o polipéptido adicional.

El péptido de la reivindicación 3, en donde el péptido adicional es una etiqueta, un péptido señal o un determinante antigénico.

El péptido de la reivindicación 3 o 4 fusionado a dicho péptido o polipéptido adicional a través de un enlazador.

Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido o péptido fusionado de cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 5.

La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o 7.

Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 8, que se puede hacer crecer en cultivo

celular.

Un método para producir el péptido o péptido fusionado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 9 y recoger el péptido producido.

Una composición farmacéutica que comprende el péptido o péptido fusionado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o 7, el vector de expresión de la reivindicación 8 o la célula huésped de la reivindicación 9.

El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o 7, el vector de expresión de la reivindicación 8 o la célula huésped de la reivindicación 9, para su uso en tratar enfermedades infecciosas o cáncer.

El péptido para uso de la reivindicación 12, en donde las enfermedades Infecciosas están causadas por infección bacteriana o vírica.

El péptido para uso de la reivindicación 12 o 13, en donde la enfermedad Infecciosa es sepsis.

Un kit que comprende el péptido o péptido fusionado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o 7, el vector de expresión de la reivindicación 8 o la célula huésped de la reivindicación 9.