Nuevos genes implicados en biosíntesis.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica al menos uno de:

a) un polipéptido MYB14 que comprende una secuencia con al menos 70% de identidad con SEC ID NO: 14, en el que el % de identidad se calcula a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO: 14; y

b) un fragmento funcional de SEC ID NO: 14;

en la que el polipéptido MYB14 en a) y el fragmento funcional en b) son capaces de incrementar la producción de taninos condensados en plantas.

Nuevos genes implicados en biosíntesis CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere a un nuevo gen o genes implicados en la biosíntesis. En particular, la presente invención se refiere a gen o genes que codifican un factor regulador que controla la expresión de genes claves implicados en la producción de taninos condensados en plantas.

TÉCNICA ANTECEDENTE

La ruta molecular de fenilpropanoides

La ruta de fenilpropanoides (mostrada en la Figura 1) produce un conjunto de metabolitos secundarios que incluyen flavonas, antocianinas, flavonoides, taninos condensados e isoflavonoides (Dixon et al., 1996; 25). En particular, la ruta biosintética de taninos condensados (CT) comparte sus etapas tempranas con la ruta de antocianinas antes de divergir hacia la biosíntesis de proantocianidinas.

Las antocianidinas son precursores de flavan-3-oles (por ejemplo, (-)-epicatequina), que son bloques de construcción importantes para los CTs. Estos cis-flavan-3-oles se forman a partir de antocianidinas mediante antocianidin reductasa (ANR), que se ha clonado para muchas especies, incluyendo A. thaliana y M. truncatula (Xie et al., 23; 24). En A. thaliana, (-)-epicatequina es el monómero de CT exclusivo (Abrahams et al., 22), pero en muchas otras especies, incluyendo legumbres, tanto (+)- como (-)-flavan-3-oles se polimerizan a CTs. La biosíntesis de estos (+)-flavan-3-oles (catequinas) alternativos está catalizada por leucoantocianidin reductasa (LAR). Esta enzima se ha clonado y caracterizado de legumbres, incluyendo el árbol de leguminosa rico en CTs Desmodium uncinatum (Tanner et al., 23), así como de otras especies tales como uvas y manzanas (Pfeiffer et al., 26). La enzima cataliza la reducción de leucopelargonidina, leucocianidina, y leucodelfinidina a afcelequina, catequina, y galocatequina, respectivamente. No se han encontrado homólogos de LAR en A. thaliana, consistente con la presencia exclusiva de bloques de construcción de CTs derivados de (-)-epicatequina en esta planta.

Mientras que la información sobre la regulación de TFs de esta ruta en semillas de Arabidopsis está bien definida, todavía se han de identificar TFs que controlan la biosíntesis de CTs de las hojas dentro de la tribu de Trifolieae. Una familia importante de proteínas TF, la familia MYB, controla un intervalo diverso de funciones, incluyendo la regulación del metabolismo secundarlo, tal como las rutas de antocianinas y de CTs en plantas. La expresión de la MYB TF AtTT2 apaga o enciende coordinadamente los genes estructurales tardíos en Arabidopsis thaliana, controlando finalmente la expresión de la ruta de CTs.

Se ha obtenido un conjunto de mutantes testa transparente (TT) de Arabidopsis thaliana (Winkel-Shirley, 22; Debeaujon et al., 21) y mutantes de semillas deficientes en taninos (TDS) (Abrahams et al. 22; 23) - todos ellos deficientes en la acumulación de CTs en el tegumento. Los estudios genéticos moleculares de estos mutantes ha permitido la Identificación de un número de genes estructurales y factores de transcripción (TFs) que regulan la expresión y especificidad tisular de la síntesis de tanto antocianinas como de CTs en A. thaliana (Waíker et al., 1999; Nesi et al., 2; 22).

Aunque la mayoría de los genes estructurales en la ruta de CTs se han identificado en un intervalo de legumbres, hasta ahora han fallado los intentos para manipular la biosíntesis de CTs en hojas manipulando mediante ingeniería la expresión de estos genes individuales. La razón principal para esto es que ninguna (o unas pocas) enzima o enzimas son limitantes de la velocidad, sino que la actividad de virtualmente todas las enzimas en una ruta se ha de incrementar para lograr un flujo incrementado global en productos finales específicos tales como taninos condensados.

Los factores de transcripción (TFs) son proteínas reguladoras que actúan como represoras o activadoras de rutas metabólicas. Por lo tanto, los TFs se pueden usar como una herramienta poderosa para la manipulación de todas las rutas metabólicas en plantas. Muchos TFs de MYB son reguladores importantes de la ruta de fenilpropanoides, incluyendo tanto la síntesis de antocianinas como de taninos condensados (Debaujon et al;, 23; Davies y Schwinn, 23). Por ejemplo, el gen TT2 (AtTT2) de A. thaliana codifica un factor TF R2R3-MYB que es expresado solamente en el tegumento durante etapas tempranas de la embriogénesis, cuando se produce la biosíntesis de taninos condensados (Nesi et al., 21). Se ha mostrado que TT2 regula la expresión de los genes estructurales biosintéticos tardíos de flavonoides TT3 (DFR), TT18, TT12 (proteína MATE) y ANR durante la biosíntesis y almacenamiento de CTs. AtTT2 determina parcialmente la expresión espacial y temporal restringida de genes, en combinación con otros dos TFs; a saber, TT8 (proteína bHLH) y TTG1 (proteína de repetición WD-4; Baudry et al., 24).

También se han dado a conocer recientemente otros TFs de MYB en uva Vitis vinifera\ (VvMYBPAI), loto y Brassica napus (BnTT2), que están implicados en la regulación de la biosíntesis de CTs (Wei et al., 27; Bogs et al., 27; Yoshida et al., 28).

También se ha mostrado que el gen AtTT2 comparte un grado de similitud con el OsMYB3 del arroz (Oryza sativa), el ZmC1 del maíz (Zea mays), AmMYBROSEA de Antirrhinum majus, y PhMYBAN2 de Petunia hybrida, genes los cuales se ha mostrado que regulan la biosíntesis de antocianinas (Stracke et al., 21; Mehrtens et al., 25).

Taninos condensados

Los taninos condensados (CTs), también denominados proantocianidinas (Pas), son polímeros coloreados, uno de varios metabolitos vegetales secundarios. Los CTs son polímeros de 2 a 5 (o más) unidades de flavonoldes (véase el compuesto (I) más abajo) que están unidas mediante enlaces carbono-carbono que no son susceptibles de ser escindidos por hidrólisis. La estructura base de flavonoldes es:

COMPUESTO (I)

Los taninos condensados están situados en un intervalo de partes vegetales, por ejemplo las hojas, tallos, flores, raíces, productos de la madera, corteza, capullos. Los CTs se encuentran generalmente en vacuolas o en la epidermis superficial de la planta.

Taninos condensados en plantas forrajeras

Las plantas forrajeras, tales como legumbres forrajeras, son beneficiosas en sistemas de ganado a base de pastura, debido a que mejoran tanto la ingesta como la calidad de la dieta del animal. También, su valor con respecto a la economía de nitrógeno (N) de pasturas con respecto a la producción de los rumiantes es considerable (Caradus et al., 2). Sin embargo, aunque produce una fuente de pienso eficaz desde el punto del coste para rumiantes de pastoreo, la pastura es a menudo subóptlma cuando se trata de satisfacer los requisitos nutricionales tanto de la microflora de la panza como del propio animal. De este modo, el potencial genético de rumiantes de pastoreo para la producción de carne, lana o leche raramente se logra en una dieta forrajera.

Las pasturas de Nueva Zelanda contienen hasta 2% de trébol blanco; mientras que el incremento de los niveles de trébol blanco en pasturas ayuda a abordar este déficit, también exacerba la Incidencia de meteorismo. El trébol blanco (Trifolium repens), el trébol rojo (Trifolium pratense) y la alfalfa (Medicago sativa) son causas bien documentadas de meteorismo, debido a la deficiencia de compuestos polifenólicos de la planta, tales como CT, en estas especies. Por lo tanto, el desarrollo de variedades de cultivo forrajeras que produzcan mayores niveles de taninos en tejido vegetal sería un desarrollo Importante en la Industria de agricultura para reducir la Incidencia de meteorismo (Burggraaf et al., 26).

En particular, los taninos condensados, si están presentes en cantidades suficientes, no solo ayudan a eliminar el meteorismo, sino también influyen fuertemente sobre la calidad de la planta, apeteclbllldad y el valor nutritivo de legumbres forrajeras, y por lo tanto pueden ayudar a mejorar el rendimiento del animal. Los beneficios de salud animal y productividad dados a conocer a partir de mayores niveles de CTs Incluyen mayores tasas de ovulación en ovejas, mayor ganancia de peso vivo, crecimiento de lana y producción de leche, cambio de la composición de la leche y efectos antihelmínticos mejorados sobre parásitos gastrointestinales (Rumbaugh, 1985; Marten et al., 1987; Niezen et al., 1993; 1995; Tanner et al., 1994; McKenna, 1994; Douglas et al., 1995; Waghorn et al., 1998; Aerts et al, 1999; McMahon et al., 2; Molan et al., 21; Sykes y Coop, 21).

Un mayor nivel de tanino condensado también representa una solución viable para reducir los gases de efecto Invernadero (metano, óxido nitroso) liberados al medio ambiente por rumiantes de pastoreo (Klngston-Smith y Thomas,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica al menos uno de:

a) un polipéptido MYB14 que comprende una secuencia con al menos 7% de identidad con SEC ID NO: 14, en el que el % de identidad se calcula a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO: 14; y

b) un fragmento funcional de SEC ID NO: 14;

en la que el polipéptido MYB14 en a) y el fragmento funcional en b) son capaces de incrementar la producción de taninos condensados en plantas.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido MYB14 comprende la secuencia de SEC ID NO: 14.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que el polipéptido MYB14, o fragmento funcional, comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 17.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEC ID NO: 1,2 ó 55;

b) un complemento de la secuencia (o secuencias) en a);

c) una secuencia con al menos 7% de identidad con una secuencia en a) o b) a lo largo de toda la longitud

de la secuencia;

d) un fragmento funcional de una secuencia en a) o b);

en la que la secuencia de c) y el fragmento funcional de d) codifican un polipéptido que es capaz de incrementar la producción de taninos condensados en plantas.

5. Un polipéptido MYB14 aislado, que comprende al menos uno de:

a) una secuencia con al menos 7% de identidad con SEC ID NO: 14, en el que el % de identidad se calcula a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO: 14; y

b) un fragmento funcional de SEC ID NO: 14;

en el que la secuencia en a) y el fragmento funcional en b) son capaces de incrementar la producción de taninos condensados en plantas.

6. Un constructo que incluye una secuencia nucleotídica como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El constructo de la reivindicación 6, que incluye:

al menos un promotor; y la molécula de ácido nucleico;

en el que el promotor está enlazado operativamente a la molécula de ácido nucleico para controlar la expresión de la molécula de ácido nucleico.

8. Una célula hospedante, célula vegetal o planta, que se ha alterado a partir del tipo salvaje al transformarla para incluir una molécula de ácido nucleico como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un constructo de la reivindicación 6 ó 7.

9. La semilla de una planta de la reivindicación 8, que se altera a partir de una semilla de tipo salvaje, transformándola para incluir una molécula de ácido nucleico como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un constructo de la reivindicación 6 ó 7.

1. Un método para producir una composición que incluye un tanino condensado, en el que el método incluye la etapa de obtener el tanino condensado a partir de una planta de la reivindicación 9, o una parte de la misma.

11. Un método para producir una planta alterada o célula vegetal usando una molécula de ácido nucleico como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para alterar la planta o célula vegetal, en el que la célula vegetal o planta se altera en al menos una de:

(a) producción incrementada de al menos un tanino condensado, o monómero del mismo, y

(b) la producción incrementada de tanino condensado se selecciona de catequina, epicatequina, epigalocatequina y galocatequina.

12. Una parte, semilla, fruto, material cosechado, propágulo o progenie de una planta de la reivindicación 9, que se modifica genéticamente para comprender al menos una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 5, o un constructo de la reivindicación 7 u 8.