Nuevos biomarcadores para la enfermedad de hígado graso no alcohólico y métodos para detectar la enfermedad de hígado graso no alcohólico que emplean dichos biomarcadores.

El uso de un biomarcador para la detección in vitro de una enfermedad de hígado graso no alcohólico,

donde dicho biomarcador comprende al menos una proteína o péptido seleccionado del grupo que consiste en precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina, que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 1, el fragmento de proteína de 35 kDa que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 2 de precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina, y el péptido parcial que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 3 de precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina.

Nuevos biomarcadores para la enfermedad de hígado graso no alcohólico y métodos para detectar la enfermedad de hígado graso no alcohólico que emplean dichos biomarcadores Campo Tecnológico La presente invención se refiere a nuevos biomarcadores para la enfermedad de hígado graso no alcohólico y a 5 métodos para detectar la enfermedad de hígado graso no alcohólico que emplean dichos biomarcadores.

Antecedentes Tecnológicos Los medios usados habitualmente para diferenciar entre un estado normal y uno no normal de un sujeto humano en base a material biológico suyo son los que se han usado mayoritariamente en diagnosis. Los métodos usados más frecuentemente son aquellos dirigidos a biomarcadores sanguíneos. En este ámbito se ha realizado la determinación 10 comparativa de la cantidad de una proteína o péptido específicos que tenga un peso molecular inferior a 10.000 o, en el caso de una proteína enzimática, que presente actividad enzimática en muestras procedentes de sujetos normales (sanos) y de individuos enfermos para ayudar en la diagnosis. Aquí, antes de la evaluación de muestras reales, se realizan mediciones sobre una serie de muestras procedentes de controles sanos y de pacientes con una determinada enfermedad, en relación a la (s) cantidad (es) o actividad (es) de proteínas o péptidos individuales o 15 múltiples específicos y a los rangos de valores normales y anormales. La muestra a evaluar se analiza a continuación mediante el mismo método y el valor resultante se juzga en función de si está en el rango normal o en el rango anormal.

En las medidas reales, se determina la (s) cantidad (es) de proteína (s) o péptido (s) específico (s) en las muestras de ensayo, tal cual o tras dilución, mediante el uso de un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA, del inglés 20 "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay") que usa anticuerpos primarios, o secundarios, marcados con una enzima que reacciona con un sustrato que produce un color al reaccionar, inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA) , radioinmunoensayo (RIA) que usa un anticuerpo primario, o secundario, marcado con un radioisótopo, y, si la proteína es una enzima, la medición de la actividad de la enzima añadiendo su sustrato y determinando la intensidad del color producido, etc. Estos métodos basados en anticuerpos se denominan métodos de marcaje con enzima, 25 fluorescencia o radioisótopo, respectivamente. Adicionalmente, existe un método en el que se determina un producto de reacción enzimática derivado del correspondiente sustrato mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) . Además, existe un método en el que la HPLC se combina con un espectrómetro de masas, denominado LC-MS/MS, y existe un método denominado monitorización de reacción seleccionada (SRM) /monitorización de reacción múltiples (MRM) que utiliza LC-MS/MS. En otro método para determinar la concentración en una muestra, 30 ésta es pretratada apropiadamente y se logra la separación de proteínas o péptidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) , y la proteína o péptido diana se determina mediante tinción con plata, tinción con azul Coomassie o tinción inmunológica (ensayo Western) que usa un anticuerpo para atacar una proteína o péptido. Adicionalmente, existe un método que utiliza espectrometría de masas para determinar la cantidad de proteína o péptido diana en muestras fraccionadas mediante cromatografía en columna. En lugar de cromatografía 35 en columna, también se pueden utilizar chips proteínicos y esferas magnéticas para el propósito de pretratamiento.

Adicionalmente, los presentes inventores han desarrollado un método inmunoMS en el que una proteína o un péptido son capturados mediante partículas esféricas (que incluyen partículas esféricas magnéticas) con un anticuerpo ligado a la proteína o al péptido, son eluidos de las partículas esféricas y se determinan mediante espectrometría de masas. Además, se ha publicado el análisis de proteínas intactas mediante espectrometría de 40 masas usando los métodos mencionados anteriormente tras digestión con tripsina, etc. (Documento de Patente 1) . En la presente memoria, se seleccionan proteínas diana intactas tanto por fraccionamiento como por adsorción sobre un adsorbente específico para ellas, y a continuación se determinan mediante espectrometría de masas.

Para la enfermedad de hígado graso no alcohólico se utilizan las siglas NAFLD (del inglés "Non-alcoholic fatty liver disease") y los pacientes de esta enfermedad, a pesar del hecho de no tener un hábito de bebida (menos de 20 g 45 diarios) , generan resultados histológicos que se caracterizan por una deposición grasa hepática que recuerda a la que se da en el daño hepático alcohólico. Se excluyen enfermedades causadas por virus tales como el HCV o el HBV o el origen autoinmune. La enfermedad se considera un fenotipo de la obesidad que acompaña al síndrome metabólico hepático. La NAFLD se divide en hígado graso simple y esteatohepatitis no alcohólica. Esta última, abreviada con las siglas NASH, es una enfermedad progresiva. La NASH frecuentemente acompaña a una fibrosis y 50 se sabe que a menudo progresa hacia la cirrosis hepática y después al cáncer hepático. Tales características han atraído la atención hacia esta enfermedad (Documento No Patente 1) . A partir de este punto en la presente especificación el hígado graso simple se denominará hígado graso.

La aparición de hígado graso puede sospecharse en reconocimientos regulares a partir de la presencia de niveles elevados de triglicéridos en sangre y se puede diagnosticar mediante una ultrasonografía abdominal y una CT. Debe 55 prestarse atención al hecho de que el 40% de los hígados grasos en pacientes que no beben vienen acompañados de daño hepático. A pesar de la observación de que el hígado graso no alcohólico progresa a NASH, no existe un test sanguíneo adecuado para NASH.

Aunque la NASH se considera un tipo grave de NAFLD, los análisis químicos sanguíneos rutinarios, específicamente los valores de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) , aumentan solo ligeramente y a menudo la enfermedad es pasada por alto. Por lo tanto, se ha destacado que es un punto importante que requiere resolución debido a que no existe un método de ensayo específico para detectarla, como en el caso del hígado graso. 5

Previamente, la secuencia de las proteínas o péptidos de cadena de fibrinógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la SEQ ID Nº 1; fibrinopéptido de tipo A que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la SEQ ID Nº 3; el complemento C4A que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la SEQ ID Nº 5; el inhibidor inter--tripsina que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la SEQ ID Nº 7; y un péptido parcial del precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter--tripsina que consiste en la secuencia 10 de aminoácidos expresada por la SEQ ID Nº 17, han sido descritos como biomarcadores para la detección de cáncer hepático (Entrada de la Base de Datos WPI con número de acceso AN 2007-061341 y Documento de Patente 2) .

Documentos previos Documento de Patente 1, JP-A-2004-333274

Documento de Patente 2, JP-A-2006-308533 15

Documento No Patente 1, "A Guide to Diagnosis and Treatment of NASH and NAFLD", editado por la Asociación Japonesa de Hepatología, 2006 (en japonés) .

Documento No Patente 2, Benkirane, N. et al, J. Biol. Chem. Vol. 268, 26279-26285, 1993.

Sumario de la invención Problemas a resolver por la invención 20

La presente invención está dirigida a presentar métodos de detección de la enfermedad de hígado graso no alcohólico, que incluye esteatohepatitis no alcohólica, usando una proteína o su péptido parcial que difiere en la presencia o la ausencia, o en la cantidad entre sujetos humanos sanos y pacientes con enfermedad de hígado graso no alcohólico o esteatohepatitis no alcohólica, y además está dirigida a presentar biomarcadores que comprenden dicha proteína y dicho péptido parcial que van a ser usados para detectar la enfermedad de hígado graso no 25 alcohólico, que incluye esteatohepatitis no alcohólica.

Medios para solucionar los problemas Los presentes inventores investigaron para descubrir los medios para detectar la enfermedad de hígado graso no alcohólico y descubrieron un fragmento de proteína y un péptido parcial del mismo que son capaces de detectar la enfermedad de hígado graso no alcohólico, que incluye esteatohepatitis no alcohólica, entre biomarcadores de 30 enfermedades hepáticas que los presentes investigadores habían descubierto con anterioridad.

Específicamente,... [Seguir leyendo]

1. El uso de un biomarcador para la detección in vitro de una enfermedad de hígado graso no alcohólico, donde dicho biomarcador comprende al menos una proteína o péptido seleccionado del grupo que consiste en precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina, que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 1, el fragmento de proteína de 35 kDa que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la 5 Secuencia Nº 2 de precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina, y el péptido parcial que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 3 de precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina.

2. El uso de un biomarcador para la detección in vitro de una esteatohepatitis no alcohólica que comprende al menos una proteína o péptido seleccionado del grupo que consiste en precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-10 alfa-tripsina, que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 1, el fragmento de proteína de 35 kDa que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 2 de precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina, y el péptido parcial que consiste en la secuencia de aminoácidos expresada por la Secuencia Nº 3 de precursor de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina.

3. Un método para la detección de enfermedad de hígado graso no alcohólico que implica la determinación en un 15 material biológico de al menos un biomarcador para la enfermedad de hígado graso no alcohólico descrito en la Reivindicación 1.

4. Un método para la detección de esteatohepatitis no alcohólica que implica la determinación en un material biológico de al menos un biomarcador para la esteatohepatitis no alcohólica descrito en la Reivindicación 2.

5. Un método para la detección de enfermedad de hígado graso no alcohólico en el cual se determina que el 20 paciente padece la enfermedad de hígado graso no alcohólico cuando, tras determinación en un material biológico de al menos un biomarcador para la enfermedad de hígado graso no alcohólico descrito en la Reivindicación 1, se observa que dicho biomarcador está presente en una cantidad superior a la de los controles normales.

6. Un método para la detección de esteatohepatitis no alcohólica en el cual se determina que el paciente padece la enfermedad de esteatohepatitis no alcohólica cuando, tras determinación en un material biológico de al menos un 25 biomarcador para la enfermedad de hígado graso no alcohólico descrito en la Reivindicación 2, se observa que dicho biomarcador está presente en una cantidad superior a la de los controles normales.

7. Un método para la detección de la enfermedad de hígado graso no alcohólico descrito en la Reivindicación 3 ó en la Reivindicación 5, donde la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento de inmunotinción, un ensayo de transferencia Western, un método de anticuerpo marcado con enzima, fluorescencia o radioisótopo, espectrometría 30 de masas, método inmunoMS o método de resonancia de plasmón superficial.

8. Un método para la detección de esteatohepatitis no alcohólica descrito en la Reivindicación 4 ó en la Reivindicación 6, donde la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento de inmunotinción, un ensayo de transferencia Western, un método de anticuerpo marcado con enzima, fluorescencia o radioisótopo, espectrometría de masas, método inmunoMS o método de resonancia de plasmón superficial. 35

9. El uso de un kit en la detección in vitro de una enfermedad de hígado graso no alcohólico para determinar al menos un biomarcador descrito en la Reivindicación 1, conteniendo dicho kit un anticuerpo o un aptámero de al menos un biomarcador descrito en la Reivindicación 1.

10. El uso de un kit en la detección in vitro de esteatohepatitis no alcohólica para determinar al menos un biomarcador descrito en la Reivindicación 2, conteniendo dicho kit un anticuerpo o un aptámero de al menos un 40 biomarcador descrito en la Reivindicación 2.

11. El uso de un kit en la detección in vitro según la Reivindicación 9 ó la Reivindicación 10, donde dicho anticuerpo o aptámero está solidificado sobre una placa o placas.