Mutantes de la proteína nucleofosmina (NPM), secuencias genéticas correspondientes y usos de los mismos.

Secuencia de oligonucleótidos aislada que codifica una versión mutada de una proteína nucleofosmina (NPM) humana NP_002511,

caracterizada por

tener una localización citoplasmática

comprender una mutación que da como resultado la pérdida de al menos uno de los residuos de triptófano en las posiciones 288 y 290,

comprender un motivo de señalización de exportación nuclear (NES) en la región C-terminal y dicha región C- terminal incluye VSLRK (SEQ ID No. 29).

Mutantes de la proteína nucleofosmina (NPM), secuencias genéticas correspondientes y usos de los mismos

La presente invención hace referencia a nuevos mutantes de la proteína nucleofosmina, secuencias genéticas correspondientes y uso diagnóstico de los mismos, monitorización de enfermedad mínima residual, evaluación de pronóstico y terapia de la leucemia mieloide aguda (LMA).

Más particularmente, la invención hace referencia a nuevos mutantes de la proteína nucleofosmina citoplasmática (NPM) y sus correspondientes secuencias genética, y al uso de los mismos como marcadores para el diagnóstico, pronóstico y terapia de la leucemia mieloide aguda con cariotipo normal.

La leucemia mieloide aguda primaria, la forma de leucemia más común en adultos, es una enfermedad que se origina en la médula ósea, más frecuentemente en una célula madre pluripotente o multipotente, ya "dedicada" a la mielopoyesis. La transformación neoplásica modifica los mecanismos que regulan la proliferación y diferenciación de la célula madre evitando la maduración de su progenie. La consecuencia de este hecho es una acumulación, principalmente en la médula ósea y a continuación en la sangre periférica y en otros órganos y tejidos, de células leucémicas (o blásticas) que proliferan de forma autónoma.

Hasta la fecha, las LMA se dividen en diferentes grupos de pronóstico basados en análisis citogénicos y en la biología molecular, para programar el mejor tratamiento. Actualmente, la terapia para la LMA se basa principalmente en la administración secuencial de diferentes fármacos quimioterapéuticos contra las células leucémicas.

Existen diferentes etapas en el tratamiento de las LMA. La primera etapa, denominada terapia de inducción, está dirigida a destruir la mayor parte de células leucémicas con el objetivo de conducir a los pacientes a lograr lo que se conoce por remisión hematológica completa, es decir la desaparición de las células leucémicas con normalización de los datos hematológicos medulares y periféricos. La destrucción de las células leucémicas que permanecen después de esta primera etapa de terapia (denominada enfermedad mínima residual) puede lograrse mediante la continuación de la quimioterapia (mantenimiento o intensificación o reinducción), seguida o no de un trasplante autólogo o alogénico (según la presencia o ausencia de factores de pronóstico negativos y a la disponibilidad de un donante). Desafortunadamente, debido a la agresividad de estos tumores malignos, el tratamiento es decisivo únicamente para el 30% de los pacientes. Existen tres aproximaciones utilizables principales para mejorar el diagnóstico y supervivencia de los pacientes afectados por LMA: i) proporcionar pruebas diagnósticas rápidas y específicas para lograr un diagnóstico más preciso y poder monitorizar la denominada "enfermedad mínima residual"; ii) identificación de los factores de pronóstico biológicos que permiten estratificar el tratamiento terapéutico de acuerdo a "categorías de riesgo" y iii) desarrollo de nuevas formas de terapia dirigida que permiten interferir con los mecanismos de transformación neoplásica inducida por algunas lesiones genéticas.

Se han perseguido algunos de estos objetivos en algunos subtipos de LMA, tales como en aquellos subtipos con traslocación t (8;21) o inv (16), que pueden ser identificados/monitorizados con extrema precisión utilizando técnicas citogenéticas/FISH o RT-PCR, y muestran un mejor pronóstico que otras formas de leucemia. Incluso en algunos subtipos como la leucemia promielocítica con traslocación (15; 17), su empleo en combinación con la quimioterapia y el ácido trans-retinoico o ATRA (un agente que directamente actúa sobre la lesión genética) ha conducido a una mejora evidente en la supervivencia de estos pacientes.

Sin embargo, estas mejoras diagnósticas/terapéuticas afectan únicamente a una minoría de las LMA. De hecho, en una parte importante de la LMA, un 40% de los casos, el análisis citogenético muestra un cariotipo normal (Grimwade et al., 1998) y representa clínica y biológicamente una categoría heterogénea (Grimwade et al., 1998; Schnittger et al., 2002; Byrd et al, 2002).

El análisis de la expresión génica de la LMA con cariotipo normal, ha sido propuesto como un medio para caracterizar los diferentes subgrupos de pronóstico (Bullinger et al, 2004; Valk et al, 2004), pero no ha permitido identificar lesiones genéticas específicamente asociadas con el cariotipo normal. Lesiones genéticas únicas hasta ahora asociadas con el cariograma normal a nivel de los genes FLT3 (Schnittger et al., 2002; Frohling et al., 2002), CEBPa (Pabst et al., 2001), y MLL (Steudel ef to the., 2003). No obstante no pueden considerarse específicas del cariotipo normal ya que están también presentes en casos de LMA con mayores traslocaciones cromosómicas (Carnicer et al., 2004), además de en la leucemia mieloide secundaria aguda (Christiansen et al., 2001).

Por lo tanto, hasta ahora, no existen ensayos diagnósticos/pronósticos o marcadores moleculares que permitan detectar y distinguir de manera específica las LMA de cariotipo normal primarias, cuya caracterización y clasificación todavía se basa en criterios morfológicos equivocados. Además, el desconocimiento sobre la lesión genética representa un impedimento para la monitorización de la enfermedad mínima residual (con dificultad relevante en las opciones terapéuticas) y para el desarrollo potencial de nuevas formas de terapia molecular para esta categoría de LMA.

A partir de lo anterior, queda clara la necesidad de proporcionar nuevos marcadores diagnósticos y pronósticos para la leucemia mieloide aguda primaria con cariotipo normal, y nuevas dianas moleculares para la terapia específica de este tipo de leucemia.

Los autores de la presente invención han identificado actualmente mutantes del gen de la nucleofosmina (NPM) y proteína nucleofosmina codificada a partir del mismo, asociados específicamente a la LMA de cariotipo normal.

La nucleofosmina (NPM) es una proteína ampliamente restringida en el nucléolo (Cordell et al., 1999) que actúa como un transportador del núcleo al citoplasma (Borer et al., 1989). Es una molécula "chaperona" (Dumbar et al., 1989), probablemente implicada en la prevención de la agregación de las proteínas en el nucléolo y la regulación del ensamblaje y transporte de las estructuras pre-ribosómicas a través de la membrana nuclear. Es también una diana de la CDK2/ciclina E. en la duplicación del centrosoma (Okuda et al., 2000) y está implicada en la regulación del mecanismo de supresión tumoral mediado por Arf-p53 (Bertwistle et al., 2004; Colombo et al., 2002; Kurki et al., 2004). En el modelo murino (ratón genéticamente deficiente o "knock-out"), el gen de la NPM parece desempeñar un papel fundamental en la regulación de la hematopoyesis (Grisendi et al., 2005).

El gen de NPM está implicado en las traslocaciones cromosómicas de las leucemias y linfomas que dan como resultado la formación de proteínas de fusión, tales como, por ejemplo, NPM-ALK (Morris et al., 1994), NPM RARE (Redner et al, 1996), y NPM-MLF1 (Yoneda-Kato et al., 1996), que conservan únicamente la región N-terminal de la molécula de NPM (Falini et al., 1999; Falini et al., 2002). Se supone que la nucleofosmina contribuye a la oncogénesis activando el potencial oncogénico del compañero de fusión (ALK, MLF1, RARa) (Bischof et al, 1997).

Ya que se supone que la NPM cumple una función en la supresión tumoral mediada por Arf/p53, las alteraciones del tráfico fisiológico desde el núcleo al citoplasma podrían ser cruciales durante la transformación. Las alteraciones en la distribución sub-celular de la NPM y/o proteínas de fusión que contienen NPM pueden ser reveladas por estudios de inmuno-histoquímica. Por ejemplo, en los denominados linfomas ALK positivos con t(2;5) (Falini et al., 1999) y leucemia aguda con t(3;5) se observa una deslocalización citoplasmática de la proteína NPM (Falini et al., 1999; Falini et al., 2002) con respecto a la localización del nucléolo que se espera de la misma NPM (Cordell et al., 1999). Este hallazgo se debe a la reactividad del anticuerpo monoclonal anti-NPM con la proteína de fusión NPM-ALK [producto de la t(2;5)] o NPM-MLF1 [producto de la t(2;5)] o NPM-MLF1 [producto de la t(3;5)] y/o con la proteína NPM deslocalizada en el citoplasma, probablemente a través de la formación de heterodímeros con NPM-MLF1.

Los autores de la presente invención han mostrado en la actualidad que aproximadamente un tercio de las LMA en adultos en el examen inmunohistoquímico muestra una distribución citoplasmática aberrante de la proteína NPM (NPMc+) (normalmente restringida... [Seguir leyendo]

1. Secuencia de oligonucleótidos aislada que codifica una versión mutada de una proteína nucleofosmina (NPM) humana NP_002511, caracterizada por

tener una localización citoplasmática

comprender una mutación que da como resultado la pérdida de al menos uno de los residuos de triptófano en las posiciones 288 y 290,

comprender un motivo de señalización de exportación nuclear (NES) en la región C-terminal y dicha región C- terminal incluye VSLRK (SEQ ID No. 29).

2. Secuencia de oligonucleótidos según la reivindicación 1, en donde en la versión mutada y codificada de la NPM NP 002511 humana ambos residuos de triptófano 288 y 290 están mutados.

3. Secuencia de oligonucleótidos según la reivindicación 1, en donde en la versión codificada y mutada de la NPM NP 002511 humana únicamente el residuo de triptófano 290 está mutado.

4. Secuencia de oligonucleótidos según la reivindicación 1, en donde la versión mutada y codificada de la NPM NP 002511 humana además comprende un D-aminoácido (ácido aspártico) aguas arriba del L-aminoácido (leucina) en el extremo N-terminal del motivo NES.

5. Secuencia de oligonucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde en la versión codificada y mutada de la NPM NP_002511 humana, dicho NES comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en LCLAVEEVSL (SEQ ID No 6); LCMAVEEVSL (SEQ ID No 7); LCVAVEEVSL (SEQ ID No 8); LSRAVEEVSL (SEQ ID No 9); LCTAVEEVSL (SEQ ID No 10); LSQAVEEVSL (SEQ ID No 11); LCI-IAVEEVSL (SEQ ID No 12); LCRAVEEVSL (SEQ ID No 13); LCRGVEEVSL (SEQ ID No 14); LCQAVEEVSL (SEQ ID No 15); LCAAVEEVSL (SEQ ID No 16); LCKAVEEVSL (SEQ ID No 17); LWQSLAQVSL (SEQ ID No 18); LWQSLEKVSL (SEQ ID No 19); LWQSLSKVSL (SEQ ID No 20); LCTFLEEVSL (SEQ ID No 21); LWQCFAQVSL (SEQ ID No 22); LWQCFSKVSL (SEQ ID No 23); LWQRFQEVSL (SEQ ID No 24); LWQDFLNRL (SEQ ID No 25); LWQSMEEVSL (SEQ ID No 26) o LWQRMEEVSL (SEQ ID No 27); y LWQCCSQVSL (SEQ ID No 28).

6. Secuencia de oligonucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde en la versión codificada y mutada de la NPM NP 002511 humana, dicho NES comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

A) DLCLAVEEVSLRK

B) DLCMAVEEVSLRK

C) DLCVAVEEVSLRK

D) DLCLAVEEVSLRK

E) DLWQSLAQVSLRK

F) DLWQSLEKVSLRK

7. Secuencia de oligonucleótidos según la reivindicación 1, en donde la versión mutada y codificada de la NPM NP 002511 humana además se caracteriza porque está fusionada a una proteína indicadora, en donde dicha proteína indicadora se selecciona del grupo que consiste en EGFP, (3-galactosidasa, luciferasa, y GFP.

8. Oligonucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el oligonucleótido es una secuencia de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o secuencias complementarias a los mismos.

9. Secuencia de oligonucleótidos según la reivindicación 8, en donde dicha secuencia de desoxirribonucleótidos incluye al menos una de las secuencias con los siguientes números de depósito del GenBank: AY740634, AY740635, AY740636, A740637, AY740638, AY740639.

10. Secuencia de oligonucleótidos según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia se marca con un agente seleccionado del grupo que consiste en una sustancia fluorescente, biotina, un radioisótopo, y una nanopartícula.

11. Método in vitro para diagnosticar la leucemia mieloide aguda y/o monitorizar la enfermedad residual detectando mutaciones de NPM según se define en la reivindicación 1, donde el método utiliza medios seleccionados del grupo que consiste en sondas de oligonucleótidos, cebadores, epítopos y anticuerpos.

12. Método según la reivindicación 11, en donde dichas mutaciones de NPM se detectan con al menos un cebador 5 y/o sonda de oligonucleótidos que reconoce una o más mutaciones de NPM, y en donde dicho cebador o sonda de

oligonucleótidos se marcan con un agente seleccionado del grupo que consiste en sustancia fluorescente, biotina, radioisótopo y nanopartícula.

13. Vector de expresión que comprende una secuencia de oligonucleótidos según se define en la reivindicación 1.

14. Células hospedadora transfectada con un vector de expresión según se define en la reivindicación 13.

15. Método de empleo de la célula hospedadora según la reivindicación 14 como un modelo de estudio de la LMA

NPMc+ para el cribado de nuevos fármacos.