Mutante del gen proB de las bacterias corineformes.

El organismo hospedante no humano que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO:

2, con lo que en las secuencias de aminoácidos la glicina en la posición 149 se sustituye por un aminoácido proteinogénico, con lo que el polipéptido tiene actividad de γ-glutamil cinasa, con lo que se sobreexpresa el polinucleótido utilizando un promotor potente de modo que la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incremente en al menos un 10% basado en la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

Mutante del gen proB de las bacterias corineformes

La presente invención se refiere a organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica una enzima que tiene actividad de y-glutamil cinasa. Más particularmente, la presente invención caracteriza organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica aquellas enzimas que tienen un aminoácido proteinogénico distinto de glicina en la posición 149 de la secuencia de aminoácidos o en una posición comparable.

Los organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica tales enzimas que tienen actividad de y-glutamil cinasa se emplean preferiblemente en la producción por fermentación de L-prolina. En el esquema 1 se representa la ruta biosintética de la L-prolina, partiendo de glutamato.

L-glutamato

(-) gamma-glutamil cinasa: proB

i 2.7.2.11

L-g I utamato-5-fosfato

glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa: proA

1.2.1.41

L-glutamato y-semialdehído

ATP

ADP

NADPH NADP fosfato

espontáneo

h2o

pirrolin-5-carboxilato-reductasa: pro C

1.5.1.2

L-prolina-*-------

L- &-pirrolin-5-carboxilato

NADP NADPH

Esquema 1

Es sabido que los aminoácidos se pueden producir fermentando cepas de, por ejemplo, bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia, se están realizando constantemente esfuerzos para mejorar los procesos de producción. Las mejoras en el procedimiento pueden implicar medidas de relacionadas con la tecnología de la fermentación, tales como, por ejemplo, la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento hasta obtener la forma del producto, por ejemplo por medio de cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de comportamiento del microorganismo propiamente dicho.

Las propiedades de comportamiento de estos microorganismos se mejoran aplicando métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. Esto da como resultado cepas que son resistentes a antimetabolitos o son auxótrofas para metabolitos importantes para la regulación y que producen aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el análogo de prolina 3,4-deshidro-DL-prolina (DHP).

Desde hace varios años se han empleado igualmente métodos de ADN recombinante para mejorar las cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácidos, amplificando genes de la biosíntesis de aminoácidos individuales e investigando el efecto sobre la producción de aminoácidos.

La secuencia nucleotídica del genoma de Corynebacterium glutamicum se describe, entre otros, en el documento EP-A-1108790, y también se ha depositado en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) con los números de acceso NC_003450.2 y BX927148.1 a BX927157.1.

Sleator et al. dan a conocer la posibilidad de provocar sobreproducción en la biosíntesis de prolina mutando el gen proB de Listeria monocytogenes (Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 4560-5). Las mutaciones especificadas allí y declaradas como exitosas implican genes de proB que codifican y-glutamil cinasas que tienen las siguientes mutaciones: V121I, A144V y E146K. Además, se hace mención al hecho de que las regiones en las que se producen estas mutaciones corresponden muy bien a la región también identificada en otros organismos como una región diana para mutaciones ventajosas.

Por lo tanto, fue el objeto de la presente invención hacer que estén disponibles organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica otras variantes proteicas m utadas y, cuando sea apropiado, mejoradas de una y-glutamil cinasa, que se pueden emplear ventajosamente en un proceso técnico para la producción de L-prolina por fermentación.

Este objeto y otros objetos que no se especifican con detalle pero que surgen de manera obvia a partir de la técnica anterior se logran partiendo de organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que

codifica las y-glutamil cinasas de la reivindicación 1. Las reivindicaciones 2 a 8 se centran en organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica enzimas preferidas de este tipo. Finalmente, las reivindicaciones 12 a 14 se refieren a un proceso de producción según la invención para la L-prolina con la ayuda de organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica las enzimas mencionadas.

Proporcionando organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica una y-glutamil cinasa (producto del gen proB) que tiene un aminoácido proteinogénico distinto de glicina en la posición 149 de los aminoácidos o en una posición comparable, sorprendentemente, aunque no menos ventajosamente, se logra de forma particular el objeto expuesto. En comparación con las enzimas de tipo salvaje, las y-glutamil cinasas que tienen una mutación apropiada ayudan a producir L-prolina de manera mejorada en un proceso de producción por fermentación. Usando los métodos según la invención, es posible mejorar el comportamiento de los organismos hospedantes no humanos o del proceso de fermentación con respecto a uno o más de los parámetros seleccionados del grupo de concentración de producto (producto por volumen), rendimiento de producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y formación de producto (producto formado por volumen y tiempo), o cualesquiera otros parámetros del proceso y sus combinaciones en al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5% o al menos 2%, basándose en la cepa de partida o cepa progenitora o el proceso de fermentación con el uso de organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica dichas enzimas.

Se da preferencia a proporcionar organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica y-glutamil cinasas en las que un aminoácido, preferiblemente el L-aminoácido, seleccionado del grupo que consiste en Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, lie, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys o Phe está presente en la posición del aminoácido como se define según la invención o en una posición comparable. (Los aminoácidos mencionados, incluyendo glicina, también se denominan en la técnica como aminoácidos proteinogénicos). Se da una preferencia muy particular a la sustitución de glicina con ácido L-aspártico en la posición 149 (G149D) en la mencionada enzima. Se sabe que las enzimas intrínsecas al hospedante no humano, denominadas aminopeptidasas, son capaces de escindir el aminoácido N-terminal metionina, separándolo de la proteína formada. Además, se sabe que la escisión de uno (1) o dos (2) y de no más de tres (3) aminoácidos del término C de la proteína altera la actividad enzimática sólo de forma insignificante como mucho, si es que lo hace. Sin embargo, la enzima puede aumentar en longitud debido a la anexión de ciertas proteínas de fusión (véase más abajo).

La presente invención también engloba organismos hospedantes no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, preferiblemente 4, o una secuencia que es al menos 90% idéntica a ella, comprendiendo las secuencias la sustitución de aminoácidos de glicina por otro aminoácido, en particular cualquiera de los aminoácidos preferidos mencionados, en la posición 149 o en una posición comparable. De este modo, la invención también engloba organismos no humanos que comprenden un polinucleótido que codifica aquellas enzimas que tienen los grados mencionados anteriormente de identidad a nivel de aminoácidos en comparación con SEC ID NO: 2, preferiblemente 4. Igualmente, estas enzimas se pueden originar a partir de fuentes naturales. Como alternativa, se pueden haber modificado mediante tecnología de ADN recombinante, de tal manera que el experto puede predecir la actividad enzimática a retener o esencialmente retenida (véase, por ejemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", 2a edición 1989, CSH Press, Coid Spring Harbor, Ausubel et al. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY 2001). De este modo, los aminoácidos que no están presentes en el sitio activo y cuya sustitución por un aminoácido "del mismo tipo" no se espera que dé como resultado, a primera vista, una estructura tridimensional sustancialmente alterada se pueden sustituir por un aminoácido "del mismo tipo". Por ejemplo, se puede esperar que ciertos aminoácidos con cadenas laterales no polares (aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. El organismo hospedante no humano que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 2, con lo que en las secuencias de aminoácidos la glicina en la posición 149 se sustituye por un aminoácido proteinogénico, con lo que el polipéptido tiene actividad de y-glutamil cinasa, con lo que se sobreexpresa el polinucleótido utilizando un promotor potente de modo que la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incremente en al menos un 10% basado en la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

2. El organismo hospedante según la reivindicación 1, en el que el intercambio de aminoácidos se selecciona de SEC ID NO: 2, en los que la glicina en la posición 149 se sustituye por un aminoácido proteinogénico.

3. El organismo hospedante según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la glicina en la posición 149 de SEC ID NO: 2 se sustituye por ácido L-aspártico.

4. El organismo hospedante de la reivindicación 3, en el que dicho polinucleótido comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 3.

5. El organismo hospedante no humano que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene desde las posiciones 145 a 154 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 145 a 154 de SEC ID NO: 2, en los que dicho polinucleótido se híbrida en condiciones restrictivas que comprenden una etapa de lavado a 0,5 SSC a 50- 68°C al complemento de SEC ID NO: 3, en los que el polipéptido tiene actividad de y-glutamil cinasa.

6. El organismo hospedante según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido codificado tiene desde las posiciones 145 a 154 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 145 a 154 de SEC ID NO: 4.

7. El organismo hospedante según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido codificado tiene desde las posiciones 110 a 189 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 110 a 189 de SEC ID NO: 2.

8. El organismo hospedante según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido codificado tiene desde las posiciones 110 a 189 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 110 a 189 de SEC ID NO: 4.

9. El organismo hospedante según las reivindicaciones 1 a 8, en el que el organismo hospedante se escoge a partir del grupo que comprende levaduras, E. coli, B. subtilis, bacterias coreniformes.

10. El organismo hospedante de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho organismo hospedante es una bacteria coreniforme.

11. El organismo hospedante según la reivindicación 10, en el que dicho organismo hospedante es Corynebacterium

glutamicum.

12. Un procedimiento para la preparación de L-prolina, que comprende

a) fermentar el organismo hospedante según una o más de las reivindicaciones 1 a 12

b) enriquecer dicho L-aminoácido en el medio o en las células de las bacterias, y

c) aislar o recoger dicho aminoácido, opcionalmente con componentes procedentes del caldo de fermentación y/o biomasa.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que se fermentan los organismos hospedantes que comprenden uno o más genes sobreexpresados escogidos del grupo que comprende:

a) el gen gdh que codifica glutamato deshidrogenasa

b) el gen proA que codifica y-glutamil-fosfato reductasa

c) el gen proC que codifica la pirrolin-5-carboxilato reductasa y

d) el gen ocd que codifica ornitina ciclodesaminasa.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que se fermenta un organismo hospedante que comprende uno o más genes atenuados escogidos del grupo que comprende:

a) el gen ilvA que codifica treonina desaminasa

b) el gen putA que codifica prolina deshidrogenasa/pirrolin-5-carboxilato deshidrogenasa

c) el gen sucA que codifica 2-cetoglutarato deshidrogenasa

d) el gen sucB que codifica dihidrolipoamida succiniltransferasa, y

e) el gen argD que codifica acetilomitina aminotransferasa.