Métodos para identificar, purificar y enriquecer células madre o inmaduras de inicio de cáncer a partir de tumores y uso de las mismas.

Método para la preparación de composiciones celulares, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de células tumorales, obtenida de un paciente,

(b) cultivar opcionalmente las células proporcionadas en (a) en un medio de cultivo;

(c) aislar en una submuestra las células FL1+ que presentan una morfología de alta FSC y baja/media SSC en la clasificación celular activada por fluorescencia y que presentan emisión de autofluorescencia detectada en el canal FL1 tras excitación por haz de láser a una longitud de onda de o de aproximadamente 488 nm mediante clasificación celular activada por fluorescencia, a partir de las células proporcionadas en la etapa (a) o (b);

(d) aislar en otra submuestra mediante clasificación celular activada por fluorescencia las células FL0 que presentan una morfología de baja/media FSC y media/alta SSC en la clasificación celular activada por fluorescencia, que no fluorescen en la etapa (c) y que presentan un ligero cambio positivo en la fluorescencia detectada en el canal FL3 y/o FL4;

(e) excluir las células muertas de cada una de las submuestras de células aisladas obtenidas en las etapas (c) y (d);

(f) reunir la submuestra de células obtenida en la etapa (c) tras el tratamiento en la etapa (e);

(g) reunir la submuestra de células obtenida en la etapa (d) tras el tratamiento en la etapa (e).

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR, PURIFICAR Y ENRIQUECER CÉLULAS MADRE O INMADURAS DE INICIO DECÁNCER A PARTIR DE TUMORES Y USO DE LAS MISMAS

Campo de la invención La presente divulgación se refiere a métodos para la preparación de composiciones celulares, a composiciones aisladas que pueden obtenerse a partir de los mismos, a composiciones celulares aisladas relacionadas, a kits y al uso de las mismas. Más específicamente, la presente divulgación proporciona un método para identificar, purificar y enriquecer células madre o inmaduras de inicio de cáncer en una muestra. Las composiciones celulares, los métodos relacionados y los usos según la presente divulgación son útiles en el tratamiento de cánceres y/o la detección de enriquecimiento de células madre o inmaduras de inicio de cáncer, especialmente cánceres del sistema nervioso central y periférico y metástasis del cerebro.

Antecedentes de la invención

Los tumores cerebrales-gliomas son los tumores cerebrales más frecuentes en adultos y, en su forma maligna, (glioblastoma multiforme o de grado IV) siguen siendo una de las enfermedades más agresivas con una tasa de supervivencia a los 5 años de menos del 5% (Reardon et al., 2006, J. Clin. Oncol., 24, 1253) . Los gliomas se clasifican en subcategorías según su semejanza fenotípica con células gliales, principalmente con astrocitos (astrocitomas) y oligodendrocitos (oligodendrogliomas) . Basándose en las características histopatológicas, los gliomas también se subdividen en tumores de bajo grado (grado I y II) y de alto grado (grado III y IV) , que tienen distinto pronóstico clínico (Reardon et al., 2006, citado anteriormente) . Pese a los avances actuales en técnicas quirúrgicas, así como en estrategias de radiación y quimioterápicas, los gliomas de alto grado siguen siendo una enfermedad devastadora con pésimo pronóstico. No se han identificado factores de riesgo medioambientales y se sabe poco sobre los mecanismos biológicos implicados en las fases de inicio y progresión de estos tumores cerebrales. Por tanto, cualquiera mejora significativa en la terapia y profilaxis de gliomas requiere una comprensión más profunda de los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo de gliomas.

La reciente identificación de células de tipo madre (SC) en varios cánceres humanos como leucemias mieloides agudas (LMA) , tumores de mama, ovario y cerebro, tiene renovado interés en la hipótesis de que pueden surgir cánceres de mutaciones somáticas en células madre/progenitoras adultas (Reya et al., 2001, Nature, 414, 105) . Una población minoritaria de células de tipo madre pueden representar el origen de la expansión, recidiva y metástasis de células tumorales, determinando por tanto el comportamiento biológico de los tumores incluyendo proliferación, progresión y posterior respuesta a la terapia (Reya et al., 2001, citado anteriormente; Galmozzi et al., 2006, Curr. Med. Chem., 13, 603) . Aunque las células madre normales y cancerosas comparten similitudes de comportamiento incluyendo autorrenovación, diferenciación en múltiples linajes, pueden diferir con respecto a su potencial tumorigénico cuando se implantan en ratones desnudos (Bonnet y Dick, 1997, Nat. Med. 3, 730) . Además, es extremadamente complejo identificar marcadores de células madre cancerosas en gliomas humanos que sean específicos para regir los fenotipos tumorales. Se están realizando muchos esfuerzos para encontrar y caracterizar marcadores específicos de células madre cancerosas, que las discriminen de células cancerosas (marcadores de células del volumen tumoral) o de células madre normales. Hasta ahora, la expresión de CD133 era la única posibilidad de purificar y enriquecer una subpoblación de células madre de glioma que muestran propiedades tumorigénicas y de autorrenovación (Singh et al., 2004, Nature, 432, 396) . Aunque se describió CD133 en otros sistemas tumorigénicos, también se expresa en células madre normales, dificultando la selección como diana específica de células cancerosas para agentes terapéuticos (Yin et al., 1997, Blood, 90, 5002; Uchida et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14720; Miraglia et al., 1998, Brood, 91, 4390) . Además, es extremadamente difícil creer que sólo un marcador sería suficiente para definir "la población de células madre de glioma" conociendo la heterogeneidad de las poblaciones de células tumorales y el conocimiento actual del sistema hematopoyético.

Por tanto, existe la necesidad de nuevos métodos que permitan una mejor estrategia de selección para la compresión adicional de las jerarquías celulares en gliomas y otros cánceres sólidos, especialmente de nuevos métodos para aislar y caracterizar completamente células de inicio y propagación de tumores que muestran propiedades de células madre, que pueden ser útiles en el tratamiento de tales cánceres.

Sumario de la invención

La presente divulgación se refiere a métodos para la preparación de composiciones celulares, a composiciones aisladas que pueden obtenerse a partir de los mismos, a composiciones celulares aisladas relacionadas y al uso de las mismas y a métodos para identificar, purificar y enriquecer células madre o inmaduras de inicio de cáncer en una muestra.

Un primer aspecto de la divulgación proporciona un método para la preparación de una composición celular según la divulgación y composiciones aisladas que pueden obtenerse a partir del mismo.

Un segundo aspecto de la divulgación se refiere a una composición celular aislada que comprende células vivas que presentan una emisión de autofluorescencia detectada en el canal FL1 tras excitación por haz de láser se aíslan mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

Un tercer aspecto de la divulgación se refiere a una composición celular aislada que comprende células vivas que presentan un ligero cambio positivo en la fluorescencia detectada en el canal FL3 y/o FL4 mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

Un cuarto aspecto según la divulgación reside en un kit que comprende al menos una composición celular según la divulgación.

Un quinto aspecto según la divulgación se refiere a un uso de una composición celular aislada según la divulgación en métodos de selección según la invención y métodos relacionados.

Un sexto aspecto según la divulgación se refiere a un método de detección de la presencia de células cancerosas madre o inmaduras en una muestra de células.

Un séptimo aspecto según la divulgación se refiere a métodos de selección para seleccionar agentes antitumorales para determinar agentes que puedan desplazar las células desde un estado tumorigénico hasta un estado no tumorigénico.

Un octavo aspecto según la divulgación se refiere a un método de detección de recidiva de células madre cancerosas en una muestra de células madre cancerosas.

Un noveno aspecto según la divulgación se refiere a un ensayo de selección que comprende o que usa una composición celular según la divulgación.

Descripción de las figuras

La figura 1 representa un esquema para un método según la invención. (a) Proporcionar una muestra reciente a partir de la muestra de células tumorales tras disociación. (b) Cultivar opcionalmente las células proporcionadas en

(a) en un medio de cultivo. (c) Aislar en una submuestra las células que presentan emisión de autofluorescencia detectada en el canal FL1 tras excitación por haz de láser a una longitud de onda de o de aproximadamente 488 nm mediante clasificación celular activada por fluorescencia, a partir de las células proporcionadas en la etapa (a) o (b) .

(d) Aislar en otra submuestra mediante clasificación celular activada por fluorescencia las células que no fluorescen en la etapa (c) y que presentan un ligero cambio positivo en la fluorescencia detectada en el canal FL3 y/o FL4. (e) Excluir las células muertas de cada una de las submuestras de células aisladas obtenidas en las etapas (c) y (d) . (f) Reunir la submuestra de células obtenida en la etapa (c) tras el tratamiento en la etapa (e) . (g) Reunir la submuestra de células obtenida en la etapa (d) tras el tratamiento en la etapa (e) .

La figura 2 muestra que las células FL1+ tienen propiedades esferogénicas mayores que las células FL10, y capacidad de autorrenovación exclusivamente a largo plazo. (A) Porcentaje de unidades esféricas secundarias formadas tras clasificación de FL1+ y FL10, y clonación a 1 célula/pocillo. Recuento de esferas evaluado a los 10 días tras la clonación. (B) Pases en serie (hasta cinco) de clones individuales derivados de una única célula FL1+ o de una única célula FL10. Mientras que pueden realizarse... [Seguir leyendo]

1. Método para la preparación de composiciones celulares, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de células tumorales, obtenida de un paciente,

(b) cultivar opcionalmente las células proporcionadas en (a) en un medio de cultivo;

(c) aislar en una submuestra las células FL1+ que presentan una morfología de alta FSC y baja/media SSC en la clasificación celular activada por fluorescencia y que presentan emisión de autofluorescencia detectada en el canal FL1 tras excitación por haz de láser a una longitud de onda de o de aproximadamente 488 nm mediante clasificación celular activada por fluorescencia, a partir de las células proporcionadas en la etapa (a) o (b) ;

(d) aislar en otra submuestra mediante clasificación celular activada por fluorescencia las células FL0 que presentan una morfología de baja/media FSC y media/alta SSC en la clasificación celular activada por fluorescencia, que no fluorescen en la etapa (c) y que presentan un ligero cambio positivo en la fluorescencia detectada en el canal FL3 y/o FL4;

(e) excluir las células muertas de cada una de las submuestras de células aisladas obtenidas en las etapas

(c) y (d) ;

(f) reunir la submuestra de células obtenida en la etapa (c) tras el tratamiento en la etapa (e) ;

(g) reunir la submuestra de células obtenida en la etapa (d) tras el tratamiento en la etapa (e) .

2. Método según la reivindicación 1, en el que la emisión de autofluorescencia detectada en la etapa (c) se detecta en el canal FL1, a una longitud de onda de o de aproximadamente 520 nm.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la emisión de autofluorescencia detectada en la etapa (c) se detecta en el canal FL1 con un espejo dicroico a 530 nm +/-15 nm.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la emisión de autofluorescencia

detectada en la etapa (c) se detecta en el canal FL1 con un espejo dicroico a 515 nm +/-5 nm. 35

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligero cambio positivo en la emisión de fluorescencia detectada en la etapa (d) se detecta a una longitud de onda > 630 nm.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se excluyen células muertas en la etapa (e) mediante adición de azul de tripano a las submuestras obtenidas en las etapas (c) y (d) .

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de células tumorales proporcionada en la etapa (a) es una muestra en la que las células se han cultivado tras la disociación de una muestra de tumor.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de células tumorales proporcionada en la etapa (a) es una muestra recién disociada de una muestra de tumor.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medio de cultivo en la etapa (b) se selecciona de un medio de células madre, un medio rico en suero y un medio de cultivo de diferenciación.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra de células tumorales proporcionada en la etapa (a) es una muestra en la que las células se han disociado de una muestra de tumor seleccionada de gliomas, schwanomas, metástasis del pulmón, metástasis del cerebro, meningiomas

y ependimomas.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra de células tumorales proporcionada en la etapa (a) se obtuvo de un paciente que padece un cáncer o que se sospechaba que padece un cáncer seleccionado de gliomas, schwanomas, metástasis del cerebro, meningiomas y ependimomas humanos o de un paciente que padece un cáncer metastásico o que se sospecha que padece un cáncer seleccionado de metástasis del cerebro por melanoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón.

12. Método de selección para seleccionar agentes antitumorales que comprende las etapas siguientes: 65

(i) combinar las células FL1+ obtenidas según el método según las reivindicaciones 1 a 11 en 19

presencia/ausencia de un agente que va a seleccionarse;

(ii) determinar la capacidad del agente para inhibir al menos una función de las células FL1+ seleccionada

de autorrenovación, tumorigenicidad, viabilidad, enriquecimiento en propiedades génicas de capacidad de

células madre, ciclo celular y funciones metabólicas.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho agente antitumoral comprende moléculas susceptibles

de tener una actividad terapéutica en un cáncer seleccionada de disminuir o suprimir el crecimiento tumoral,

prevenir, disminuir o suprimir la recidiva del cáncer.