Métodos para el diagnóstico y tratamiento de la esclerosis múltiple.

Un método para el diagnóstico de la esclerosis múltiple en un sujeto humano,

que consiste en lo siguiente:

evaluación de un nivel de uno o más 15-oxiesteroles en una muestra de suero de un sujeto humano a través de un método que consiste en someter la muestra de suero a la extracción de lípidos y analizar la muestra utilizando un cuádruplo en tándem GC-MS/MS; y

comparar el nivel de 15-oxiesterol de la muestra con un nivel de referencia,

donde el nivel de 15-oxiesterol de la muestra en comparación con la referencia es indicativo de si el sujeto padece esclerosis múltiple.

de ios dibujos

Las FIG. 1A y 1B son conjuntos de tres gráficos de barras que muestran unos niveles séricos aumentados de 15-HC en un humano y en la EMPS experimental. 1A, La concentración de 15-oxiesteroles se midió utilizando GC/MS en controles sanos (n=10), pacientes con EMRR (n=12) y EMPS (n=10). Los pacientes con EMRR presentan niveles aumentados de 15-KE (panel izquierdo) y 15-KA (panel central), pero no 15-HC (panel derecho), mientras que los pacientes con EMPS presentan niveles incrementados de todos los 15-oxiesteroles en comparación con los controles sanos y los pacientes de RRMS. 1B, La concentración de 15-oxiesteroles (15-KE (panel izquierdo), 15-KA (panel central) y 15-HC (panel derecho)) se midió en el pico del ataque agudo (día 18) o durante la fase de progresión (día 55) de la EMPS NOD experimental. Los datos se expresan como la media ± SEM (error estándar de la media).

Las FIG. 2A-C muestra que la inhibición de la PARP-1 frena la pérdida axonal y la discapacidad progresiva en la EMPS experimental. 2A, un gráfico de líneas que muestra los resultados del tratamiento con AIQ cuando se indujo la

EMPS experimental en ratones diabéticos no obesos (NOD) de 10 semanas de edad mediante inmunización subcutánea con 10 mg de MOG35-55 en CFA y toxina Pertussis (150 ng por ratón) administrada en el momento de la inmunización y 48 horas más tarde. Se administró AIQ (3 mg/Kg de peso corporal) diariamente comenzando el día 0, n=10 animales por grupo. Un grupo de control se trató con PBS. 2B, un par de gráficos de líneas muestran los resultados del análisis de la progresión de la encefalitis autoinmune experimental (EAE) (panel superior - fase aguda, panel Inferior - fase crónica). 2C, cuatro imágenes del análisis hlstopatológlco de la EAE en ratones NOD. Se tomaron secciones representativas de la médula espinal de cada grupo el día 55, se tiñeron con azul luxol rápido (dos imágenes superiores) o plata de Bielschowsky (dos imágenes Inferiores) para analizar la desmielinizaclón o la pérdida axonal, respectivamente. Los gráficos de barras de la derecha de la figura muestran un significativo descenso del porcentaje de desmielinización (arriba) y del porcentaje de pérdida axonal (abajo) tras el tratamiento con AIQ.

Las FIG. 3A-D muestran que la Inhibición de la PARP-1 no Interfiere con la respuesta encefalltogénlca adaptatlva en la EMPS experimental. 3A, dos gráficos de barras que muestran los resultados cuando los esplenocitos de ratones tratados con un vehículo o con AIQ se sometieron a ensayo para determinar su respuesta de memoria proliferala a la MOG35-55 (panel derecho) o antl-CD3 (panel izquierdo). No se observaron diferencias estadísticas entre los dos grupos (ANOVA de una vía, P>0,05, media ± SEM). 3B, un conjunto de seis fotomicrografías de células mlcrogllales y macrófagos de infiltración del SNC teñidos con anticuerpos para lba-1 (arriba a la Izquierda), astrocltos con anticuerpos para GFAP (abajo a la Izquierda), y la activación de PARP-1 fue seguida de anticuerpos para PAR (fila central); a la derecha se muestran las imágenes fusionadas. 3C, un gráfico de barras que muestra los resultados de una medición de la actividad enzimàtica de PARP-1 en células CD1 lb+ del SNC aisladas de ratones tratados con AIQ o ratones de control en el día 55 (ANOVA de una vía, P<0,01, media ± SEM). 3D, un gráfico de barras que muestra la actividad enzimàtica de PARP-1 en monocitos de la sangre periférica aislados de controles sanos, pacientes con EMRR y EMPS (media ± SEM).

Las FIG. 4A-D muestran los resultados de la activación de microglías, macrófagos y astrocitos por 15-HC. 4A, un gráfico de barras que muestra la actividad de PARP-1 en un sistema libre de células donde la PARP-1 recombinante se Incubó con ADN previamente tratado con 15-HC o 7-KC. Se utilizó ADN no pretratado como control negativo y proteínas de unión a ADN de cadena sencilla como control positivo. Los datos se expresan como la media ± SEM. 4B, un par de gráficos de barras que muestran la actividad de PARP-1 medida en microglías, macrófagos o astrocltos Incubados con 15-HC o 7-KC. Los datos se muestran por las veces de cambio entre el vehículo y las células tratadas con lípldos (media ± SEM). 4C, un par de gráficos de barras que muestran el porcentaje de Inhibición de la actividad de PARP-1 en las microglías, los macrófagos o los astrocltos activados con 15-HC o 7-KC (10 mg/ml) en presencia de 5-AIQ. 4D, una tabla que muestra los niveles de TNF-a, CCL-2 y secreción de NO de las microglías, los macrófagos o los astrocltos (media ± SEM) tratados con 15-HC o 7-KC.

Las FIG. 5A-D son gráficos de barras que muestran eventos de señalización que median en la activación de PARP-1 por parte de 15-HC, lo que Indica que los 15-oxlesteroles pueden activar la PARP-1 vía daño de ADN. 5A, un gráfico de barras que muestra la progresión temporal de la activación de la PARP-1 de las microglías por parte de los 15- oxlesteroles o 7-KC. La actividad de PARP-1 se muestra como la media ± SEM. 5B, un conjunto de ocho gráficos de barras que muestran las vías de señalización activadas por 15-HC. Las células mlcrogliales se estimularon con 15- HC y se sometieron a Usado cuando habían transcurrido 1, 5 y 15 minutos. Se produjeron matrices de transducdón de la señal con los Usados y se sometieron a una sonda con anticuerpos fosfoespecíflcos. 15a-HC incrementa la fosforilación de TAK1 (arriba a la derecha), IRAK (arriba a la Izquierda), Akt (segunda fila a la Izquierda), p38 MAPK (segunda fila a la derecha), Pyk2 (tercera fila a la Izquierda), PKC (tercera fila a la derecha), PI3K (última fila a la Izquierda), y Erkl/2 (última fila a la derecha). (Media ± SEM) 5C, un gráfico de barras que muestra la activación de la PARP-1 mlcrogllal por 15-HC en presencia de Inhibidores de qulnasas (Media ± SEM). 5D, un ¡nmunoensayo y un gráfico de barras que muestra los resultados de la colnmunopreclpltaclón de ERK y PARP-1. Las células mlcrogllales se trataron con 15-HC, se Usaron, se ¡nmunopreclpltaron con anticuerpos para Erk fosforllado y el material obtenido se sometió a una sonda con anticuerpos para PARP-1.

Las FIG. 6A-B son gráficos de barras que muestran que la activación de PARP-1 por 15-HC está mediada por TLR2A. El anticuerpo de bloqueo de TLR2 anula la activación de PARP-1 por 15a-HC. 6A, un conjunto de tres gráficos de barras que muestran la actividad de PARP-1 en las microglías, los macrófagos o los astrocltos activados con 15-HC en presencia de anticuerpos de bloqueo para TLR2 o TLR4, o controles de ¡sotlpos (Media ± SEM). 6B, un gráfico de barras que muestra la actividad de PARP-1 en células HEK-293 transfectadas o no con un plásmldo que codifica TLR2 y activadas con 15-HC (Media ± SEM).

La FIG. 7 es un conjunto de ocho gráficos de barras que muestran que la respuesta Inmune encefalltogénlca adaptatlva no se ve afectada por la Inhibición de PARP-1. Los esplenocitos preparados con ratones de control o tratados con AIQ se activaron /n v/fro con MOG35-55 (columna de la derecha) o anticuerpos para CD3 (columna de la Izquierda) y se testaron los niveles de cltoqulnas en el supernatante a las 48 horas. Fila superior, IFN-gamma. Segunda fila, IL-17. Tercera fila, IL-10. Fila Inferior, TGF-beta.

La FIG. 8 es un conjunto de ocho pares de gráficos de Bolt y de barras que muestran el bloqueo de las vías de señalización activadas por 15-HC con anticuerpos de bloqueo para TLR2. Las células mlcrogllales se Incubaron con 10 mg/ml de anticuerpo de bloqueo de TLR2 o control del ¡sotlpo 45 minutos antes de la adición de 15-HC al medio y los eventos de transducdón de la señal se analizaron por ¡nmunoensayo Western blot.

La FIG. 9 es un conjunto de ocho gráficos de barras que muestran las vías de señalización activadas por 15-HC, validadas por inmunoensayo Western blot. Se analizaron lisados de células preparados en condiciones similares a las utilizadas para la construcción de RPA por inmunoensayo Western blot, con el fin de detectar los niveles de proteina fosforilada y totales de los objetivos de interés identificados con RPA. Se muestra el ratio de proteina fosforilada/proteína total.

Las FIG. 10Ay 10B son gráficos de barras que muestran la activación mediada porTLR2 de PARP-1 mediante 15- HC. La actividad enzimàtica de PARP-1 (10A) y TNF alfa y CCL2 (10B) de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se incubaron con 15-HC solamente, o en combinación con AIQ, anticuerpos de bloqueo para TLR2 o control de IC.

Las FIG. 11A-B muestran los resultados de la detección basada en FACS de la actividad de PARP-1. 11 A, un conjunto de cinco histogramas que muestran la tinción de PAR (detectada por FACS) de PBMC Incubadas con 15- HC solamente, o en combinación... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico de la esclerosis múltiple en un sujeto humano, que consiste en lo siguiente:

evaluación de un nivel de uno o más 15-oxlesteroles en una muestra de suero de un sujeto humano a través de un método que consiste en someter la muestra de suero a la extracción de lípldos y analizar la muestra utilizando un cuádruplo en tándem GC-MS/MS; y

comparar el nivel de 15-oxlesterol de la muestra con un nivel de referencia,

donde el nivel de 15-oxlesterol de la muestra en comparación con la referencia es Indicativo de si el sujeto padece esclerosis múltiple.

2. El método de la reivindicación 1, donde se selecciona uno o más 15-oxlesteroles del grupo compuesto por 15- ketocolesteno (15-KE), 15-ketocolestano (15-KA) y 15-hldroxlcolesteno (15-HC).

3. El método de la reivindicación 1, donde el nivel de referencia es una referencia de control que representa un nivel normal del 15-oxlesterol.

4. El método de la reivindicación 3, donde el nivel normal es un nivel en un sujeto humano no afectado.

5. El método de la reivindicación 1, donde el nivel de referencia es una referencia de la enfermedad que representa un nivel de los 15-oxlesteroles en un sujeto humano de referencia que padece esclerosis múltiple.

6. El método de la reivindicación 5, donde el sujeto humano de referencia padece esclerosis múltiple recurrente- remitente (EMRR) o esclerosis múltiple progresiva secundarla (EMPS).

7. Un método para determinar si un sujeto humano padece esclerosis múltiple recurrente-remitente (EMRR) o esclerosis múltiple progresiva secundarla (EMPS), donde el método consiste en lo siguiente:

evaluación de un nivel de uno o dos 15-oxlesteroles (15-ketocolesteno (15-KE) y 15-ketocolestano (15-KA)), así como la evaluación de la presencia y/o el nivel de 15-hldroxlcolesteno (15-HC), en una muestra de suero de un sujeto humano a través de un método que consiste en someter la muestra de suero a la extracción de lípidos y analizar la muestra utilizando un cuádruplo en tándem GC-MS/MS; y

comparar el nivel de 15-KE y/o 15-KA, y 15_HC en la muestra con las correspondientes referencias,

donde el nivel de 15-KE y/o 15-KA y 15-HC de la muestra en comparación con la referencia de control es indicativo de si el sujeto padece EMRR o EMPS.

8. El método de la reivindicación 7, donde la referencia es una referencia de control que representa un nivel normal de 15-KE o 15-KA y 15-HC en un sujeto no afectado, o una referencia de la enfermedad que representa un nivel en un sujeto humano que padece EMRR o EMPS.

9. El método de la reivindicación 7, donde la presencia de niveles elevados de 15-KE o 15-KA, así como unos niveles elevados de 15-HC en comparación con una referencia, Indica que el sujeto padece EMPS o un mayor riesgo de desarrollar EMPS, mientras que unos niveles aumentados de 15-KE y 15-KA, pero no de 15-HC en comparación con la referencia Indica que el sujeto humano padece EMRR o que todavía no ha progresado a EMPS.

10. Un método para el diagnóstico de la EMPS en un sujeto humano, que consiste en lo siguiente:

evaluación del nivel de 15-hldroxlcolesteno (15-HC) en una muestra de suero de un sujeto humano a través de un método que consiste en someter la muestra de suero a la extracción de lípldos y analizar la muestra utilizando un cuádruplo en tándem GC-MS/MS; y

comparar el nivel de 15-HC de la muestra con la correspondiente referencia,

donde el nivel de 15-HC de la muestra en comparación con la referencia es Indicativo de si el sujeto padece EMPS.

11. El método de la reivindicación 10, donde la referencia es una referencia de control que representa un nivel normal de 15-HC en un sujeto humano no afectado y/o una referencia de la enfermedad que representa un nivel en un sujeto humano que padece EMPS.

12. El método de la reivindicación 11, donde la referencia es una referencia de control que representa un nivel normal de 15-HC en un sujeto humano no afectado y la presencia de un nivel elevado de 15-HC Indica que el sujeto humano padece EMPS.