Métodos para aumentar la secreción de polipéptidos que tienen actividad biológica.

Método para producir una enzima de beta-glucosidasa, que comprende:

(a) transformación de una célula huésped fúngica con un constructo de proteína de fusión que codifica una proteína de fusión, donde el constructo de proteína de fusión comprende:

(i) un primer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal obtenido a partir de un gen de endoglucanasa (cel45) de Humicola insolens CEL45;

(ii) un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un dominio catalítico de una endoglucanasa obtenida a partir de un gen de endoglucanasa (cel45) de Humicola insolens CEL45; y

(iii) un tercer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de betaglucosidasa obtenida a partir de Aspergillus oryzae,

donde la proteína de fusión es SEC ID nº: 74,

(b) cultivo de la célula huésped fúngica transformada bajo condiciones adecuadas para la producción de la proteína de fusión; y

(c) recuperación de la proteína de fusión del medio de cultivo.

Métodos para aumentar la secreción de polipéptidos que tienen actividad biológica Declaración sobre los derechos de las invenciones realizadas a continuación Investigación y desarrollo sufragados con fondos federales

[1] Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno bajo el Subcontrato NREL n° ZCO- 317-2, Contrato Principal DE-AC36-98GO1337 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

[2] La presente invención se refiere a métodos de producción de polipéptidos segregados que tienen actividad biológica y a proteínas de fusión y polinucleótidos derivados.

Descripción de las técnicas relacionadas

[3] La producción recombinante de un polipéptido heterólogo en una célula huésped fúngica, particularmente una célula fúngica filamentosa tal como Aspergillus o Tríchoderma o una célula de levadura tal como Saccharomyces, puede proporcionar un vehículo más deseable para la producción del polipéptido en cantidades comercialmente importantes.

[4] La producción recombinante de un polipéptido heterólogo segregado se realiza generalmente por construcción de un casete de expresión donde el ADN que codifica para el polipéptido está operativamente enlazado a un promotor adecuado para la célula huésped y una región codificante del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada en marco al amino terminal del polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El casete de expresión se introduce en la célula huésped, normalmente por transformación mediada por plásmido. La producción de la proteína heteróloga segregada se consigue entonces por cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones inductoras necesarias para el funcionamiento apropiado del promotor contenido en el casete de expresión.

[5] Mientras que la expresión de un polipéptido heterólogo en una célula huésped se puede mejorar, a menudo se encuentra el obstáculo de que el polipéptido se segrega poco en el medio de cultivo. Un método para mejorar la secreción del polipéptido es reemplazar la secuencia codificante del péptido señal nativo con una región codificante del péptido señal foráneo para mejorar la secreción del polipéptido. No obstante, en algunos casos, tal sustitución no proporciona una mejora suficiente para producir el polipéptido en cantidades comercialmente relevantes. Otro método es fundir el polipéptido con otro polipéptido que sea altamente segregado por una célula huésped. El polipéptido altamente segregado funciona como un portador para transportar el polipéptido poco segregado o no segregado como una proteína de fusión a través de la vía secretora de la célula.

[6] La WO 5/935 divulga una proteína de fusión compuesta por un dominio catalítico de exo-celobiohidrolasa y un dominio catalítico de celulasa para aumentar el rendimiento de una enzima de celulasa. Gouka et al., 1997, Applied and Environmental Microbiology Feb. 1997, p. 488-497, divulgan fusiones de gen de glucoamilasa que alivian las limitaciones para la producción de proteína en el Aspergillus awamori. Niissonen y Keranen, 1995, Current Genetics 28: 71-79, divulgan funciones múltiples de la celobiohidrolasa I en la producción mejorada de anticuerpos de fusión por Tríchoderma reesei.

[7] Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos para aumentar la secreción de polipéptidos que tienen actividad biológica.

Resumen de la invención

[8] La presente invención se refiere a métodos para producir un polipéptido segregado que tiene actividad biológica, que comprende:

(a) transformación de una célula huésped fúngica con un constructo de proteína de fusión que codifica una proteína de fusión, donde el constructo de proteína de fusión comprende:

(i) un primer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal;

(ii) un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un dominio catalítico de una endoglucanasa o una parte de la misma; y

(iii) un tercer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos

un dominio catalítico de un polipéptido que tiene actividad biológica o una parte del mismo; donde la proteína de fusión es SEC ID n°: 74,

(b) cultivo de la célula huésped fúngica transformada bajo condiciones adecuadas para la producción de la proteína de fusión; y

(c) recuperación de la proteína de fusión, un componente de la misma, o una combinación de la misma, a partir del medio de cultivo, donde la proteína de fusión o el componente

Breve descripción de las figuras

[9]

La figura 1 muestra un mapa de restricción de pMJ4.

La figura 2 muestra un mapa de restricción de pCaHj527.

La figura 3 muestra un mapa de restricción de pMT2188.

La figura 4 muestra un mapa de restricción de pCaHj568.

La figura 5 muestra un mapa de restricción de pMJ5.

La figura 6 muestra un mapa de restricción de pSMa¡13.

La figura 7 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de una secuencia de señal nativa de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (SEC ID n°: 59 y 6).

La figura 8 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de una secuencia de señal de endoglucanasa V de Humicola insolens (SEC ID n°: 63 y 64).

La figura 9 muestra un mapa de restricción de pSMa¡135.

La figura 1 muestra un mapa de restricción de pSMa¡14.

La figura 11 muestra un mapa de restricción de pSaMe-F1.

La figura 12 muestra un mapa de restricción de pSaMe-FX.

La figura 13 muestra un mapa de restricción de pAILo47.

Las figuras 14A, 14B, 14C y 14D muestran la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína de fusión de la variante de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (SEC ID n°: 73 y 74, respectivamente). Las figuras 15A, 15B, 15C y 15D muestran la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (SEC ID n°: 75 y 76, respectivamente).

Definiciones

[1] Actividad de endoglucanasa: el término "actividad de endoglucanasa" se define aquí como una endo-1,4-beta-D- glucano 4-glucanohidrolasa (E.C. 3.2.1.4), que cataliza la endohidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en la celulosa, derivados de la celulosa (tales como la carboximetilcelulosa y la hidroxietil celulosa), liquenina, enlaces beta- 1,4 en glucanos mezclados beta-1,3 tales como beta-D-glucanos de cereal o xiloglucanos, y otro material vegetal que contenga componentes celulósicos. Para fines de la presente invención, la actividad de endoglucanasa se determina usando la hidrólisis de carboximetil celulosa (CMC) según el procedimiento de Ghose, 1987, Puré and Appl. Chem. 59: 257-268. Una unidad de actividad de endoglucanasa se define como 1, pmol de azúcares reductores producidos por minuto a 5°C, pH 4,8.

[11] Actividad de beta-glucosidasa: el término "beta-glucosidasa" se define aquí como una beta-D-glucósido glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21), que cataliza la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa no reductora terminal con la liberación de beta-D-glucosa. Para fines de la presente invención, la actividad de beta-glucosidasa se determina según el procedimiento descrito por Venturi ef al., 22, J. Basic Microbiol. 42: 55-66, excepto que se utilizan condiciones diferentes como se describe en este caso. Una unidad de actividad de beta-glucosidasa se define como 1, pmol de p- nitrofenol producido por minuto a 5°C, pH 5 de 4 mM de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido como sustrato en 1 mM de citrato sódico, ,1% de TWEEN® 2.

[12] Polipéptido en toda su longitud: el término "polipéptido en toda su longitud" se define aquí como una forma precursora de un polipéptido que tiene actividad biológica, donde el precursor contiene una región de péptido señal y alternativamente también una región de propéptido, donde tras secreción de una célula, el péptido señal se divide y alternativamente también el propéptido se divide produciendo un polipéptido con actividad biológica.

[13] Péptido señal: el término "péptido señal" se define aquí como un péptido enlazada en marco al amino terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en una vía secretora de la célula.

[14] Secuencia codificante de péptido señal: el término "secuencia codificante de péptido señal" se define aquí como una región codificante de péptido que codifica para una secuencia de aminoácido enlazada... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una enzima de beta-glucosidasa, que comprende:

(a) transformación de una célula huésped fúngica con un constructo de proteína de fusión que codifica una

proteína de fusión, donde el constructo de proteína de fusión comprende:

(i) un primer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal obtenido a partir de un gen de endoglucanasa (cel45) de Humicola insolens CEL45;

(ii) un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un dominio

catalítico de una endoglucanasa obtenida a partir de un gen de endoglucanasa (cel45) de Humicola insolens CEL45; y

(i¡¡) un tercer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de beta- glucosidasa obtenida a partir de Aspergillus oryzae,

donde la proteína de fusión es SEC ID n°: 74,

(b) cultivo de la célula huésped fúngica transformada bajo condiciones adecuadas para la producción de la proteína de fusión; y

(c) recuperación de la proteína de fusión del medio de cultivo.

2. Célula huésped fúngica transformada con una proteína de fusión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1.