Métodos de expansión celular y usos de células y medios acondicionados producidos de este modo para terapia.

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células estromales adherentes procedentes de tejido placentario o adiposo para uso en el tratamiento de una afección que puede beneficiarse de la facilitación del agarre de injerto de células madre hematopoyéticas en un sujeto,

en donde las células estromales adherentes procedentes de tejido placentario o adiposo han sido cultivadas en condiciones de cultivo tridimensionales que apoyan la expansión celular.

Métodos de expansión celular y usos de células y medios acondicionados producidos de estemodo para terapia Campo y antecedentes dela invención La presente invención se refiere a usos terapéuticos de células adherentes procedentes de placenta o tejidos adiposos cultivadas en condiciones de cultivo tridimensionales, por ejemplo para trasplante de células madre hematopoyéticas.

En el mundo médico en desarrollo existe una creciente necesidad de células madre adultas en grandes cantidades para uso en injerto de células e ingeniería tisular. Además, la terapia con células madre adultas se encuentra en continuo desarrollo para tratar y curar diversas afecciones tales como trastornos hematopoyéticos, cardiopatía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, quemaduras, distrofia muscular, trastornos autoinmunitarios, diabetes y artritis.

Las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) son células precursoras que dan origen a todos los tipos de células sanguíneas tanto del linaje mieloide como del linaje linfoide. El agarre del injerto y el inicio de la hematopoyesis por HSC trasplantadas depende de la capacidad de estas células para asentarse y proliferar dentro de la médula ósea (MO) del receptor.

Es de aceptación general que las células madre están íntimamente asociadas in vivo con nichos discretos de la médula que proveen señales moleculares que intervienen colectivamente en su diferenciación y autorrenovación, a través de contactos célula-célula o de interacciones de corto alcance. Estos nichos forman parte del "microentorno inductivo hematopoyético" (HIM) , compuesto por células de la médula, es decir, macrófagos, fibroblastos, adipocitos y células endoteliales. Las células de la médula mantienen la integridad funcional del HIM al proporcionar proteínas de matriz extracelular (ECM) y componentes de la membrana basal que facilitan el contacto célula-célula. También proporcionan diversas citocinas solubles o residentes necesarias para la diferenciación y proliferación controladas de células hematopoyéticas.

Las interacciones entre las HSC y el estroma son necesarias para mantener la viabilidad de las HSC y evitar su diferenciación. Después del trasplante de HSC, las HSC trasplantadas deben asentarse en el microentorno de la médula ósea (MO) y alojarse en los nichos adecuados antes de que proliferen y se diferencien. Durante el proceso de asentamiento, las HSC trasplantadas abandonan el torrente sanguíneo y transmigran siguiendo un gradiente de quimiocinas a través de la barrera de células endoteliales de la MO para llegar a los nichos dedicados. A continuación, las HSC del donante deben asentarse en los nichos hematopoyéticos, donde encuentran un microentorno más favorable para la división de las HSC, y donde se puede establecer un continuo de contactos físicos y químicos entre las HSC y las células mesenquimales, la ECM y los factores de crecimiento secretados. Todos estos procesos implican un complejo abanico de moléculas, tales como citocinas, quimiocinas, hormonas, esteroides, proteínas dematriz extracelular, factores de crecimiento, proteínas de interacción célula-célula, proteínas de adhesión y proteínas dematriz.

El número total de células injertadas en los nichos dedicados de la MO determina el éxito de un trasplante de HSC. Para conseguir el agarre del injerto, las HSC de donante que se trasplantan a la circulación sanguínea deben asentarse en la médula del receptor, donde generan focos funcionales de hematopoyesis. El número de estos focos se calcula como el producto del total de HSC transfundidasmultiplicado por su eficacia de agarre del injerto.

Uno de los principales problemas relacionados con el trasplante de HSC es la escasa tasa de supervivencia de estas células en el sistema aceptor. Está bien documentado que las HSC trasplantadas intravenosamente son retiradas de la circulación y se visualizan en la MO en el transcurso de algunos minutos después de su transfusión. Al cabo de tres a cinco horas desde el trasplante de HSC, no se detectan células de donante en la sangre periférica de los receptores [Askenasy et al. 2002 Transplanted hematopoietic cells seed in clusters in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20:301-10]. La gran mayoría de las células trasplantadas son destruidas al poco tiempo de haber sido transfundidas. En consecuencia, la colonización de la médula del receptor presenta una baja eficacia, y sólo 1-5% de las células transfundidas son detectadas en la MO del receptor a los 2-3 días tras el trasplante [Kerre et al. 2001 Both CD34+38+ and CD34+38-cells home specifically to the bone marrow of NOD/LtSZ scid/scid mice but show diferent kinetics in expansion. J Immunol. 167:3692-8; Jetmore et al. 2002 2002 Homing efficiency, cell cycle kinetics, and survival of quiescent and cycling human CD34 (+) cells transplanted into conditioned NOD/SCID recipients. Blood. 99:1585-93].

Las células estromales mesenquimales (MSC) son una población heterogénea de células, capaces de diferenciarse en diferentes tipos de células mesenquimales maduras. La diferenciación de estas células a células endoteliales reticulares, fibroblastos, adipocitos y células precursoras osteogénicas, depende de la influencia de diversos factores bioactivos.

El uso de MSC para apoyar el agarre del injerto de HSC es conocido en la técnica. Varias publicaciones han demostrado mayores eficacias de agarre de injerto de HSC cuando se cotrasplantan éstas con células madre mesenquimales [Gurevitch et al. 1999 Transplantation of allogeneic or xenogeneic bone marrow within the donor

stromal microenvironment. transplantation. 68:1362-8; Fan et al. 2001 Successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT) by injection of bone marrow cells via portal vein: stromal cells as BMT-facilitating cells. [Stem Cells. 19:144-50]. También se ha demostrado que el cotrasplante de células madre mesenquimales humanas en un modelo de injerto humano-ovino, produce la mejora del agarre de injerto a largo plazo de MO quimérica de HSC humanas en los animales [Almeida-Porada et al. 2000] Co-transplantation of human stromal cell progenitors into preimmune fetal sheep results in early appearance of human donor cells in the circulation and boosts cell levels in bone marrow at later time points after transplantation [Blood. 95:3620-7]. Se ha hallado que la inyección simultánea de HSC y células madre mesenquimales acelera la hematopoyesis [Zhang et al. 2004. Stem Cells. 22:1256-62]. Recientemente, estos hallazgos han sido extendidos a un modelo animal más cercano -el mono Rhesus. Cuando se cotrasplantaron HSC haplo-idénticas y células madre mesenquimales, se demostró un agarre facilitado del injerto de HSC [Liu et al. 2005 Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 26:385-8]. También se ha informado recientemente del uso de células madre mesenquimales para favorecer el agarre del injerto de HSC en pacientes humanos [Koc ON, J Clin Oncol. 2000;18:307-316; Lazarus HM, Biol Blood Marrow Transplant. 2005 May;1 1 (5) :389-98].

Aparentemente, la contribución de las MSC al agarre de injertos hematopoyéticos reside en la producción de citocinas de apoyo a HSC que ayudan a mediar y equilibrar los potenciales de asentamiento, autorrenovación y compromiso de las HSC trasplantadas, en reconstruir el microentorno hematopoyético dañado que se necesita para el asentamiento y proliferación de las HSC y en la inhibición de las células T derivadas del donante, que pueden provocar enfermedad de injerto contra huésped (EICH) , [Charbord P., y Moore, K., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1044: 159-167 (2005) ; patentes de EE.UU. nºs 6, 010, 696, 6, 555, 374]. Por ejemplo, en un estudio de Maitra, [Maitra B, et al., Bone Marrow Transplant. 33 (6) :597-604. (2004) ], se ha encontrado que células madre mesenquimales humanas apoyan a células madre hematopoyéticas de donante no emparentado y suprimen la activación de células T en el modelo de ratón NOD-SCID, demostrando que MSC no emparentadas, derivadas de médula ósea humana, pueden mejorar el resultado de untrasplante alogénico.

Un obstáculo principal en el uso de las MSC reside en la dificultad para aislar grandes cantidades de poblaciones normalmente presentes de estas células, lo cual es técnicamente difícil y costoso debido en parte, a la limitada cantidad de células. La fuentemás obvia de MSC es la médula ósea, pero la considerable incomodidad implicada en la obtención de aspirados de médula ósea y el riesgo de la biopsia constituyen inconvenientes de estos métodos. La creencia, ampliamente extendida, de que el embrión y el feto humanos representan una vida independiente hace al embrión humano una fuente problemática de células madre, añadiendo un aspecto religioso y ético a las... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células estromales adherentes procedentes de tejido placentario o adiposo para uso en el tratamiento de una afección que puede beneficiarse de la facilitación del agarre de injerto de células madre hematopoyéticas en un sujeto, en donde las células estromales adherentes procedentes de tejido placentario o adiposo han sido cultivadas en condiciones de cultivo tridimensionales que apoyan la expansión celular.

2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1 en donde la facilitación del agarre de injerto de células madre hematopoyéticas comprende aumentar el número de células hematopoyéticas del sujeto.

3. La composición farmacéutica según la reivindicación 2 en donde la facilitación del agarre de injerto de células

madre hematopoyéticas comprende aumentar el número de células hematopoyéticas que expresan marcador CD45+.

4. La composición farmacéutica según la reivindicación 1 en donde el sujeto es un sujeto irradiado.

5. La composición farmacéutica según la reivindicación 1 en donde el sujeto es inmunodeficiente debido a quimioterapia.

6. La composición farmacéutica según la reivindicación 1 en donde las células estromales adherentes cultivadas secretan ligando Flt-3, IL-6 y SCF al medio de cultivo.