Método para la separación física de "traductomas" convolucionados.

Método para la separación física de "traductomas" convolucionados.

Este método se basa en una rápida lisis para todos los socios presentes en ReBiVaS (relaciones biológicas de varios socios) y ReBiVaS-AD, (relaciones biológicas de varios socios altamente desequilibradas) seguida de un procedimiento de aislamiento que permita la separación de los "traductomas" individuales de cada uno de los socios. Los diferentes "traductomas" involucrados en ReBiVaS y ReBiVaS-AD son capturados por medio de un número igual de tipos de anticuerpos con especificidad hacia una proteína-r específica de cada uno de dichos "traductomas". Tras su captura en resinas de cromatografía independientes y colocadas en tandem, dichos "traductomas" son eluídos por separado.

Se propone el desarrollo de anticuerpos específicos para zonas no conservadas de proteínas ribosómicas (proteínas-r) de modo que diferentes "traductomas" presentes en una misma muestra puedan ser fácilmente separados.

MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN FÍSICA DE TRADUCTOMAS CONVOLUCIONADOS

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un método que permite la separación física de traductomas convolucionados. Específicamente este método permite la obtención de traductomas individuales a partir de muestras que contienen traductomas de varios organismos para su posterior análisis por medio de técnicas GWA.

ANTECEDENTES PE LA INVENCIÓN

Tradicionalmente, las respuestas genéticas se han estudiado gen a gen. Si bien estos enfoques reduccionistas han aportado importantes conocimientos sobre los mecanismos que controlan dichas respuestas, también han puesto de manifiesto la enorme complejidad subyacente a las mismas. Hoy en día sabemos que los cambios en los patrones de expresión génica pueden implicar cientos, sino miles de genes. Como resultado, se ha hecho evidente que una comprensión clara de estas respuestas génicas sólo se puede lograr a través de un análisis completo, a nivel de gepojqq global (GWA, del itiglés Genome Wlde Analysis), de los cambios en la expresión génica. Dichos estudios se han hecho hoy en día posibles gracias a la aparición de las técnicas de alto rendimiento (HT, del inglés

High Throughput) para el estudio de los perfiles de expresión génica. Las técnicas HT son capaces de producir datos científicos que revelan la relación entre el genotipo y el fenotipo de una manera sin precedentes. Dentro del conjunto de técnicas HT, la recientemente descrita técnica 5 llamada perfilamiento ribosómico (RP, del inglés Ribosome profiling) permite mediciones cuantitativas, a nivel de genoma global, de los niveles de proteínas recién sintetizadas.

Hasta ahora, RP sólo se ha aplicado para estudiar los perfiles de expresión 10 en sistemas biológicos simples bajo condiciones de laboratorio. Sin embargo RP ofrece un gran potencial para revelar las respuestas génicas complejas asociadas con relaciones biológicas de varios socios (ReBiVaS).ReBiVaS incluyen relaciones biológicas de mucha importancia como infecciones, simbiosis, mutualismos, parasitismos, 15 biofilms de varios socios, las comunidades de contaminación biológica o biofouling, etc. La posibilidad de comprender las complejas respuestas génicas asociadas a ReBiVaS podría tener importantes consecuencias para el control racional de dichas relaciones biológicas. Por ello existe un sentido de urgencia en la aplicación de técnicas de GWA para el análisis 20 de las respuestas génicas que subyacen ReBiVaS. La información obtenida podría conducir la identificación de nuevas dianas moleculares importantes para el desarrollo de fármacos así como para el diseño de nuevas herramientas de biocontrol. Desde el punto de vista económico, se espera que el impacto de estudios GWAS de ReBiVaS sea elevado.

Dado que las respuestas génicas individuales que conducen a la creación

de ReBiVaS están influenciadas por las respuestas de los otros socios en la relación, ser capaz de medir simultáneamente cómo todas estas respuestas evolucionan en el tiempo, es un paso obligatorio hacia la consecución de un entendimiento profundo de estos fenómenos. Este 5 atractivo concepto, denominado aquí análisis multi- genómico global (AMGG) seguramente planteará importantes desafíos técnicos. El aislamiento de material suficiente para estudios AMGG de tales sistemas ReBiVaS puede ser particularmente difícil por las siguientes razones: 1) la cantidad de material es, en la mayoría de ios casos, mucho menor que en 10 los estudios realizados in vitro y 2) la separación de los organismos involucrados en estos relaciones es un proceso difícil y tedioso, que fácilmente puede comprometer la calidad final del material aislado. Este punto ha sido previamente mencionado por otros autores y confirmado por nuestros experimentos preliminares. El problema es particularmente grave 15 en el caso de ReBiVaS en los que la muestra se halla dominada por material de uno (o más) de los socios, es decir ReBiVaS altamente desequilibradas ReBiVaS-AD La superación de los retos tecnológicos impuestos por ReBiVaS-AD permitirían estudiar cuantitativamente y a nivel de genoma global las interacciones génicas existentes entre 20 huéspedes y patógenos o parásitos que podrían arrojar luz sobre las bases moleculares de muchos importantes enfermedades humanas, animales y de plantas. Por ejemplo, estudios AMGG de procesos infecciosos en pescados y mariscos podrían impactar drásticamente las prácticas de acuicultura. Tales estudios podrían ser de suma importancia para la 25 economía de Galicia, una de las principales regiones acuícolas en Europa. La aplicación de AMGG al estudio de las respuestas génicas asociadas a

la formación de biofílms y comunidades de biofouling contaminación biológica también podrían tener un gran impacto médico y económico. En resumen, la aplicación de AMGG al estudio de ReBiVaS es la siguiente frontera lógica en el estudio de los perfiles de expresión génica.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Así, hemos diseñado un modelo simplificado de ReBiVaS-AD para su análisis por medio de AMGG. Nuestros resultados preliminares están de acuerdo con la idea de que, al igual que en estudios de proteómica, los protocolos actuales de RP no pueden satisfacer los desafíos técnicos impuestos por estos importantes sistemas biológicos. Por lo tanto, el logro de alta resolución en estudios AMGG de ReBiVaS-AD parece fuera del alcance de los métodos actuales de RP. Una posible solución al problema podría ser proporcionada por el hecho de que todos los traductomas (colección de ribosomas celulares implicados en el proceso de traducción) que forman parte de ReBiVaS se pueden distinguir sobre la base de la identidad de sus ribosomas constituyentes. Por lo tanto, la consecución de un método que pudiera separar físicamente los traductomas individuales presentes en ReBiVaS-AD ofrece una posible vía para la deconvolucion eficaz de los perfiles de expresión génica individuales en una fase previa al análisis bioinformático. Un método para conseguir dicha separación de traductomas se ofrece a continuación.

DESCRIPCIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN

PREFERIDA

El método se basa en una rápida lisis para todos los socios presentes en 5 ReBiVaS y ReBiVaS-AD, seguida de un procedimiento de aislamiento simple y robusto que permita la separación de los traductomas individuales de cada uno de los socios. En concreto, describimos aquí una nueva tecnología que permita separar físicamente traductomas mixtos, de modo que dichos traductomas puedan analizarse por separado mediante 10 protocolos de RP. Creemos que el desarrollo de estas herramientas biotecnológicas que pueden ampliar el alcance actual de RP.

Un factor crucial para el establecimiento de RP como una herramienta de medición cuantitativa de la expresión génica es la posesión de un método 15 de generación de huellas ribosómicas (fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas) cuyas secuencias indiquen la posición de los ribosomas activos en el proceso de traducción. Salvo que todos los socios puedan ser fácilmente separados previamente al aislamiento de dichos traductomas, todos ellos serían aislados conjuntamente en caso de utilizarse la 20 tecnología estándard de RP. Es decir, los traductomas involucrados en las respuestas génicas correspondientes a sistemas ReBiVaS estarían convolucionados. El hecho de que traductomas de diferentes organismos puedan ser distinguidos en base a la especificidad de sus ribosomas constituyentes, ofrece una posible vía para la deconvolución de 25 todos los perfiles de expresión génica participantes en sistemas ReBiVaS.

Dicha tecnología podría ser crucial para la consecución de RP en sistemas ReBiVaS-AD. El método aquí presentado persigue dicha deconvolución por medio de técnicas de cromatografía de afinidad.

La cromatografía de afinidad ha sido utilizada ampliamente para el aislamiento de traductomas. En todos los métodos reportados, dicha cromatografía se basa en la adición al ribosoma de un epitopo proteico o de una etiqueta ribonucleica, que pudieses ser reconocida por anticuerpos específicos o por proteínas con alta afinidad al ARN. Dado que en el caso 10 de ReBiVaS-AD el etiquetamiento a priori de los traductomas no es posible, el método para deconvolucionar dichos traductomas tendrá que reconocer variaciones estructurales inherentes al organismo de origen de los traductomas. El uso de anticuerpos dirigidos a proteínas-r ha sido ampliamente documentado tanto para la realización de estudios 15 topológicos del ribosoma a baja resolución como para el aislamiento de ribosomas mediante la inmunoprecipitación. La cromatografía...

1. MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN FÍSICA DE

TRADUCTOMAS CONVOLUCIONADOS, caracterizado porque consta de dos etapas: Etapa 1: preparación de antígenos y Etapa 2: preparación de anticuerpos.

2. MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN FÍSICA DE

TRADUCTOMAS CONVOLUCIONADOS, en todo de acuerdo con la reivindicación anterior, en el que para el caso de una ReBiVaS-AD de dos socios, el método se compone de 2 columnas cargadas con resinas que contienen anticuerpos inmovilizados con especificidades para los ribosomas del organismo A (columna 1, cargada con resina anti-ribosomas A) y para el organismo B (columna 2, cargada con resina anti-ribosomas B). Las resinas A y B se hallan conjugadas químicamente a anticuerpos que específicamente se unan a ribosomas del organismo A (anti A) o ribosomas del organismo B (anti B). Tras una lisis rápida para los dos organismos, los dos traductomas se hallan físicamente convolucionados. El lisado se introduce en la columna 1, donde la resina anti-ribosomas A separa dichos ribosomas de los ribosomas B. Estos últimos ribosomas pasan a la columna B donde son inmovilizados en la resina anti-ribosomas B. De este modo los dos traductomas pueden ser eluídos por separado.

3. MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN FÍSICA DE TRADUCTOMAS CONVOLUCIONADOS, en todo de acuerdo con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los 5 diferentes traductomas involucrados en ReBiVaS y ReBiVaS-AD

son capturados por medio de un número igual de tipos de anticuerpos con especificidad hacia una proteína-r específica de cada uno de dichos traductomas.

4. MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN FÍSICA DE

TRADUCTOMAS CONVOLUCIONADOS, caracterizado

porque se desarrollan anticuerpos específicos para zonas no conservadas de proteínas ribosómicas (proteínas-r).